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CRISPR助你一步制备新型gRNA文库

CRISPR­Cas9系统是一种强大的基因组编辑工具,如风暴一般席卷了整个基因组工程领域。最近人们开始探索这一系统在其他方面的应用,而这样的应用往往需要同时表达一对gRNA,比如用Cas9切口酶进行大片段删除。


纪念斯隆­凯特琳癌症中心的研究团队开发了一种简单又便宜的文库制备方法,可以快速有效的将配对gRNA克隆到表达载体上,用于体内和体外的功能筛选。这一成果发表在8月17日的Nature Communications杂志上,文章的通讯作者是纪念斯隆­凯特琳癌症中心的Andrea Ventura


CRISPR/­Cas9是细菌在漫长的进化过程中演化出的重要防御机制。这个监控体系能够根据引导RNA(gRNA)的指示,靶标并降解入侵者的遗传物质。现在,CRISPR­Cas9已经成为了炙手可热的基因组编辑工具,帮助世界各地的研究者们解决实际问题。近年来,这一技术在多个领域中展现了自己强大的实力,催生了大量的重要成果。人们发现,同时表达内切酶Cas9与gRNA,可以诱导真核细胞发生双链DNA断裂。在真核生物中,双链DNA断裂主要通过容易出错的非同源末端连接进行修复,会在目标位点形成小indel(插入缺失)。


因此,CRISPR­Cas9系统是破坏基因编码框的一种简单途径。研究表明,CRIPSR­Cas9可以高效靶标多个基因,实现大规模的功能缺失筛选。研究人员开发了一个快速制备配对gRNA文库的有效方法,大大拓展了CRIPSR在功能筛选方面的应用。该方法可以将寡核苷酸池中的一对gRNA克隆到任意CRISPR 表达载体上,还可以确保两个gRNA使用独立的启动子。


研究显示,一个慢病毒载体上的两个gRNA不适合使用相同的启动子。研究人员为此构建了新型慢病毒载体,搭载一个人类U6启动子和一个经过改良的鼠类U6启动子。这项研究为人们提供了一个简单、快速又便宜的配对gRNA文库制备法,大大拓展了CRISPR技术在功能基因组学研究中的应用前景。

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