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cell-free DNA在非肿瘤疾病中的临床价值

近期我们在开展一个优化cfDNA quantification 和 qualification 方法学的小课题。尽管这个课题的初衷,是为了更精准地开展ctDNA研究提供一个技术基础,但我认为cfDNA,包括我们这个小课题的价值,并不仅限于此。现将课题立项阶段,我对cfDNA在非肿瘤疾病中的应用前景的思考分享给大家。

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再谈Cell-free DNA的历史


Cell-free DNA最早的发现就不是在肿瘤患者的血样中,他是1947年由法国科学家Mendel和Metais在健康人的血清和血浆中通过高氯酸沉淀的方法发现了存在DNA。但在那个时候,人类都还没有意识到DNA是遗传物质(1953年DNA双螺旋的发现才给足DNA作为遗传物质的名分),因此并没有充分地引起大家重视。


人们第一次发现肿瘤和血清中的DNA含量存在一定关系是在1977年,但当时并无法知道这些DNA是否来自于肿瘤细胞还是正常组织。直到1989年,人们才通过DNA链的热力学稳定性比较,第一次确定在肿瘤患者血浆中发现的DNA有一部分是来自于肿瘤细胞的。与肿瘤不同,cfDNA最早引发医学界普遍重视是在20世纪60年代,当时人们在系统性红斑狼疮的患者体内发现很高水平的cfDNA。


因此,从Cell-free DNA的科学发现史上看,我们就有理由相信它不是肿瘤生物学的专宠。


Cell-free DNA的来源


Cell-free DNA的来源主要有两种。一种就是细胞凋亡过程中产生的“DNA ladder”式的片段化核酸,它们的大小基本上在150-200bp左右。还有一种就是细胞被裂解——这种裂解既可以来源于物理性刺激引发的坏死,也可以是免疫细胞杀伤作用。这种过程产生的核酸很大,会接近基因组DNA大小。当然,不管是哪一种方式产生的cfDNA,它们都会进一步在外周血中被快速清除——这个时间可能是数十分钟至数小时不等,但机制尚不清楚。还有一些极痕量的cfDNA,会存在于不同类型囊泡结构中,如exosome。它们会相对来说稳定一些,但是由于量太少,在此不着重讲述。


从cfDNA的来源来看,我们能得到两个信息:


cfDNA实际上是一种机体细胞损伤的产物,不管它是来自细胞凋亡,还是细胞裂解。


基于cfDNA较短的半衰期,我们可以认为检测到的cfDNA含量,是实时地反映了DNA的释放和清除两方面因素平衡后的情况。目前,尚无研究系统地阐明cfDNA在血液中被清除的主要机制。因此,大家通常默认DNA的释放机制,是决定cfDNA含量的核心因素——换句话说,我们看到的cfDNA多/少了,自然地推论是产生这些cfDNA的细胞群体增多/减少了。


理解这两点,对于理解cfDNA的潜在临床价值很有帮助。


Cell-free DNA与机体细胞损伤相关疾病


如上所述,cfDNA来源于机体细胞损伤,因此我们可以做一个思维实验:对于健康的人,他血液中的cfDNA主要来源是体细胞正常的新陈代谢,因此应该维持在一个较低的水平。然而,当有很严重的系统性器官损伤时,大量死亡的细胞(不管是凋亡或是坏死)会产生大量的cfDNA。因此,我们就有可能通过cfDNA的含量变化,来对这类型疾病进行一个评估。


事实上,这样的假设是成立的。目前已经有很多文献,证实在包括系统性红斑狼疮在内的风湿性关节炎,肾小球肾炎,胰腺炎,炎症性肠病、肝炎等炎症疾病患者血浆中,都能够显著性地检测到cfDNA相比健康人群含量大大增加。


因此,似乎cfDNA的临床应用方向,更多地是和显著性的机体细胞损伤这一病理性情境相关联。但是,这个结论可能还要排除掉一些特殊情况。我能想到的一种情形,就是短时程,急性的器官性损伤,例如药物的毒性。因为对于代谢较快的药物来说,它发挥细胞毒性时间窗口较窄,相应地引发的细胞损伤造成的cfDNA检测窗口也会较窄。因此,我们很可能检测不到预期的cfDNA的含量和细胞毒性成正比。


我的这个感觉,其实来源于ctDNA含量在肿瘤化疗疗效监测中的数据。大部分的数据显示,肿瘤化疗效果好,ctDNA的含量是降低的,而并非上述“机体细胞损伤”假说中的相应升高。我的解释是,ctDNA监测的时间通常都是在接受化疗后1周,甚至2周,而这个阶段,药物已经代谢殆尽,故不是化疗药物最主要的杀伤窗口,而更多是一个反映肿瘤负荷的窗口——尽管这个时候肯定也会存在一些肿瘤细胞源于治疗的死亡,但相比之下肿瘤负荷的降低对ctDNA的含量影响更为显著。


因此,持续性的机体细胞损伤(这种持续时间,应该显著性地长于cfDNA的清除周期),对于cfDNA在临床上的应用,可能也是必要参考的。那么cfDNA在临床应用方面,还有哪些潜在的问题亟需解决呢?


Cell-free DNA在临床应用中亟需突破的局限性


cfDNA的可衡量参数太少



说白话,就是我们分析cfDNA能够测什么——暂时主流只能测含量。一种检测对象,可衡量的参数越多,对不同临床应用的区分度就会越好,也就是我们常说的特异性会更好。ctDNA为什么比cfDNA在作为biomarker方面更有优势,因为它能够测定碱基序列特征,这就大大拓展了ctDNA衡量尺度的多元化。因此,在我们的项目中,也刻意设置了一些关于cfDNA新的参数,期待看到这些参数在临床应用中体现出特别的含义。


cfDNA的人群基线波动性太大


由于cfDNA与机体体内细胞新陈代谢速率和细胞损伤(如慢性炎症等)相关,因此,对于我们每个不同程度亚健康状态的个体来说,可以想象个体间的差异将会是非常显著的。在一个基线都不稳定的水平下,怎么设定一个相对代表性的cut-off值(即使cfDNA的测量方法是完美的clinical test grade),这本身就是一个难题。我的一个预测,cfDNA的应用可能会参照炎症因子测定,用监测零点的基线水平做均一化(当然合理的基线水平是肯定要确定了,超过了这一变化范围,cfDNA检测的敏感度肯定是大受影响),随后关注cfDNA的fold change,而并不是简单的绝对数值。


cfDNA的特异性很差


这种特异性较差,与前两点局限性是同根同祖,密不可分的。换句白话说,我不可能通过cfDNA的含量数值,或者变化趋势判断究竟是哪里的机体细胞发生损伤。


或者说个ctDNA中类似的观点,我不可能(至少很难很难)在最高分辨率的影像学没有发现原发灶肿瘤之前,通过TP53,KRAS,BRCA1等等的突变判断你哪个器官得了肿瘤。


因此,cfDNA的应用,必须要基于特定的临床应用情境,也就是圈定在“高危人群”中使用,例如接受异体器官移植患者,已经明确诊断的系统性红斑狼疮。只有在这种比较明确“机体细胞损伤”发生来源的“高危人群”中,cfDNA的含量变化才有可能跟更明确的病情进展相联系,才有可能辅助临床干预决策。


cfDNA检测能否比现有手段更好


在没有分子生物学技术高速发展的时候,临床医学已经发展出很多检测手段用来评估cfDNA打算应用的临床舞台。例如肝损伤有一整套肝功能指标,肾损伤有一整套肾功能指标,自身免疫性疾病有一整套评价标准,它们现在看起来用得还不错。即使针对cfDNA本身,现有的评估体系中也有基于anti-dsDNA,anti-ssDNA抗体的ELISA与我们熟悉的核酸检测技术(如PCR,测序等)竞争。


那么cfDNA能够从哪些方面超越现有水平呢?可以努力的方向有:检测流程更快速,成本更低(尽可能实现血浆的直接测试,摆脱cfDNA抽提);定量更客观准确,比现有指标更精确地反映疾病进展;检测更灵敏,比现有指标创造出更大的干预窗口。

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