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核糖核酸分子及其构造作用研究迎来新高潮

当Philip Bevilacqua决定研究一个活体植物细胞中所有核糖核酸(RNA)分子的形态时,他面临两个问题:首先,自从中学时代起,他就没有研究过与植物相关的生物学;其次,生物化学家倾向于检测单个RNA分子,因为处理一个细胞内的众多RNA分子是个更加棘手的挑战。

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Bevilacqua是美国宾夕法尼亚大学帕克分校RNA化学家,他并没有被这个难题吓退。他知道,RNA分子是细胞生物学的重要调节器,它们的结构可能会透露其工作机制的重要秘密。为此,他重新参加了本科生课程学习植物解剖学,同时与植物分子生物学家Sarah Assmann合作,研究一种可以大规模处理RNA的技术。


2013年11月,Bevilacqua和Assmann的团队成为首个描述单个活体细胞中成千上万RNA的科学团队,并且揭示了真正意义上的野生拟南芥(又称阿拉伯芥)各种不同的“雕塑花园”。1个月后,旧金山加州大学的一个团队发表了一项研究酵母和人类细胞的比较研究。该团队研究的RNA结构数量是“史无前例”的,北卡罗来纳大学教堂山分校(UNC)RNA生物学家Alain Laederach说。


过去几年,科学家对RNA的态度已经发生了转变。从前,多数RNA被认为是像“软面条”一样的乏味物质,其主要作用是在重要的分子——如脱氧核糖核酸(DNA)和蛋白质——之间传递信息。现在,生物学家已经认识到,RNA还发挥着许多其他重要的基础功能:它们帮助蛋白合成,控制基因活动,并修饰其他RNA。此外,还有研究显示,至少有85%的人类基因组经历基因转录后成为RNA,而事实的确如此。


纷杂的结构


然而,一直以来却存在一个难解的谜题,即RNA纷繁复杂的结构。和形成可预测双螺旋结构的DNA不同,RNA由单纤维链条组成,而且会折叠成各种精妙的回路、凸起、假结以及“发卡”状的三维结构。这些结构会以不同的形式翻转和扭曲,它们被认为是RNA发挥作用的关键所在,然而对于其具体工作机制目前尚不了解。“这就是丢失了的了解RNA如何运转的那块拼图。”生物物理学家、酵母和人类RNA研究成果领头人Jonathan Weissman说。


过去几年,研究人员逐渐在这一研究领域站稳脚跟。Bevilacqua、Weissman以及其他研究人员已经发明出各种技术,可窥探到细胞内大量RNA的配置概况。研究人员还发现,当RNA在人工条件下折叠时,这些分子和自然观察中看到的完全不同。这项工作正在帮助科学家破译控制RNA结构的一些密码,相关研究或有助于了解人类基因变异和疾病,甚至是改良农作物。


“相关研究会触及一些最基本的问题,例如生物如何演化、这些分子机制如何影响人类外表和人体功能等。”Laederach,“作为一名生物学家,这样的研究让人兴奋。”


对于RNA结构的最佳描述是UNC生化学家KevinWeeks提出的“RNA岩石”:在进化过程中,序列或结构发生细微改变的分子。它们包括转移RNA和核蛋白体RNA(两种RNA均参与蛋白质合成)以及酶性核酸(或称核酶)。“但是在RNA的世界中,这些可能都算是异常值。”Weeks说。


RNA的世界就像未被探索过的流沙地带。“我们对绝大多数RNA的结构都不了解。”加州大学尔湾分校化学家Robert Spitale说。当它们从其DNA模板制备完成之后,RNA分子通常表现为由核苷酸组成的线性结构。它们会迅速发生折叠,互补的核苷酸会相互结对。然后,它们会进一步扭曲成复杂的三维结构,从而和蛋白质以及其他RNA发生反应,并根据不同的任务改变自身的结构形状。


大多数探测RNA结构的技术都在利用核苷酸的反应活性,或者利用核苷酸对一些酶的敏感性:那些结成对的RNA区域和那些维持单链结构的区域会表现出不同反应活性。接下来,科学家会利用计算机程序辅助模拟分子的整体结构。但是这些实验极为艰苦费力,因为研究人员每次只能监测一个分子的一小部分。


复杂的机理


然而,随着RNA结构平行分析技术(PARS)(由斯坦福大学遗传学家Howard Chang和以色列魏茨曼科学研究学院计算生物学家Eran Segal研发)的到来,这一局面已经在5年前发生了转变。这种技术利用一种酶切断单链条RNA,并利用另一种酶切割双链RNA。研究人员分别用两种酶处理一种RNA样本,从而制造出两个切断的RNA的信息文库;他们随后对两种RNA进行了测序和分析,以了解哪种核苷酸可以结对,并且即便RNA结构发生上千种变化依然可以立即结对。


Chang和Segal首先把PARS技术用于刚刚萌芽的酿酒酵母,以了解3000多种信使RNA的结构,这些RNA掌握着构建蛋白质的密码。尽管这些RNA的结构稀奇古怪,科学家还是发现了解码RNA结构的一个线索:编码蛋白质的RNA区域普遍比那些非编码区的旁侧序列拥有更多结对RNA,而且这些RNA的结构也更加复杂。Chang表示,这样的模式有一定合理性,因为非编码区经常和调节蛋白质发生相互作用,所以需要处于一个更加开放、可及的定位。


去年,紧随这项研究之后,一项由研究生Yue Wan主导的研究聚焦了人类信使RNA。研究人员检查了采集自一对父母与其孩子血液细胞系中2万多个信使RNA的结构。研究发现,不负责编码蛋白质的RNA区域约有1900个单核苷酸变异,这些RNA的结构也发生了改变。现在的问题是,这些变化是否会影响RNA的功能,或者这些变异最多只是一些背景噪音。


至少有一些证据表明这些变异很重要。今年5月,Laederach和团队报告了非编码区信使RNA变异和一种叫作成视网膜细胞瘤(或遗传性眼癌)的罕见病存在关联。在健康人群中,这种信使RNA会同时以3种结构存在,但是在罹患该疾病的2名病人中,核苷酸变异迫使分子仅能以一种方式存在。Laederach认为,类似的信使RNA折叠变异即便是一种普遍的发生机制,也可能是人类一些常见特征如身高变异的根源。


然而,PARS技术也有一个主要缺陷,这种技术采用的酶很难轻易渗入细胞膜,因为科学家必须从细胞中提取RNA,而这样做会扰乱其自然结构。从原理上讲,结对可以确保RNA反弹至它们在试管中重新折叠时的形状。但事实上,这种技术会除去与RNA结合的蛋白质,这一过程会严重改变RNA的分子结构。


研究新出路


为了得到活体RNA结构,很多科学家把目标转向了硫酸二甲酯(DMS),这种化学物质可以渗透至细胞内部,在那里它可以和4种RNA的核苷酸中的2种——腺嘌呤和胞嘧啶——发生反应,但其前提条件是核苷酸必须处于不结对的状态。研究人员随后把RNA转化为DNA,并对其进行了测序。研究发现,任何在DMS作用下发生改变的核苷酸都会阻止RNA转化为DNA,因此,科学家可以事先利用DNA缩短的片段分辨没有结对的核苷酸。


很多科学家希望可以看到更多折叠在一个细胞中的RNA,因为他们认为互作蛋白会让细胞内的RNA结构处于稳定状态。但是,Weissman和团队的发现与此相反。现在他们认为,这种现象可能是因为细胞中的信使RNA在主动生成蛋白质——而更松散的分子对于细胞的蛋白合成机制来说更易于获得。


然而,DMS方法也有缺陷,该方法仅能揭示出可以结对的2种核苷酸。为了获得细胞内每个RNA分子的结对信息,Chang和Spitale采用了一种叫作SHAPE的结构探测技术。该技术可以让他们推断小鼠胚胎干细胞中的19000多种RNA分子结构,相关研究成果于今年年初发表。研究人员表示,对信使RNA进行常见的化学改性,就可以解开这种分子的结构特征。他们还探测到一些独特的结构“签名”——这些特征可预测蛋白质在哪里与RNA结合,从而控制RNA的形状。


一些研究人员已经开始采用这种技术。Assmann和Bevilacqua正在利用大米探测RNA的结构,并计划用其他重要农作物开展同样的实验。他们希望可以找到操控RNA形状的方法,从而提高作物耐受性和产量。


与此同时,Rouskin正试图研究果蝇的RNA,以便进一步了解这些分子结构如何影响胚胎发育。“现在,我们终于有了一种研究工具。”她说,“我们也终于可以就以前那些甚至不敢想象的问题发问了。”


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