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组建CRISPR-Cas9库,让标记DNA和靶向切割更精准

CRISPR-Cas9系统,被称为第三代基因编辑技术。自3年前发明这一技术以来,由于它能够很容易地结合并切割非常特异的DNA序列、失活基因,CRISPR-Cas9如暴风般横扫基因组学领域。这为靶向基因疗法治愈遗传疾病,及发现疾病的病因带来了巨大的希望。

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相比于它的两位前辈ZFN系统和TALEN系统,它有着一些无可比拟的优点。


首先,CRISPR-Cas9系统的可用位置更多。理论上基因组中每8个碱基就能找到一个可以用CRISPR-Cas9进行编辑的位置,可以说这一技术能对任一基因进行操作,而TALEN和ZFN系统则在数百甚至上千个碱基中才能找到一个可用位点,这大大限制了使用范围。


其次,CRISPR-Cas9系统更具有可拓展性,例如可以通过对Cas9蛋白的修饰,让它不切断DNA双链,而只是切开单链,这样可以大大降低切开双链后带来的非同源末端连接造成的染色体变异风险。此外还可以将Cas9蛋白连接其他功能蛋白,来在特定DNA序列上研究这些蛋白对细胞的影响。


第三,更为重要的是,CRISPR-Cas9系统的使用极为方便,只需要简单的几步就能完成,几乎任何实验室都可以开展工作,而不需要向ZFN和TALEN那样借助商业公司的协助完成。


由于以上特点,CRISPR-Cas9被评为2013年生物学10大突破之一。


来自加州大学伯克利分校的研究人员发现了一种更廉价及简单的方法即通过编辑相关的函数组建CRISPR-Cas9库,让热门的基因编辑工具CRISPR-Cas9靶向切割或是标记DNA。此外,还可以调整这一技术,借助于一种荧光标记结合及标记DNA,使得研究人员能够定位和追踪正在分裂的活体细胞细胞核中成千上万基因其中的某一基因。


7月23日发表在《发育细胞》(Developmental Cell)杂志上的一篇文章详细描述了这一称作为CRISPR-EATING的过程:新开发的技术现在使得构建出让CRISPR-Cas9精确靶向DNA的向导RNA变得更加的容易。确切来说,所需材料的成本不到100美元,任何人都可以生成成千上万、覆盖生物体整个基因组的精确引导探针。


在原理论证研究中,研究人员将常见肠道细菌――大肠杆菌的整个基因组变成了覆盖88%细菌基因组的包含4万个向导RNAs的文库。每个向导RNA都是一个长20个RNA碱基对的片段:CRISPR-Cas9利用它作为模板来找出互补DNA结合并进行切割,首先需要将成千上万的探针各自导入培养板上数十万细胞的单个细胞中,构建的文库可用于传统的CRISPR-Cas9系统编辑靶向基因组中任何特定的DNA序列并切割它。


当研究人员试图阐明某一基因的功能时就可通过敲除这一基因,看看细胞中会发生什么不好的事情,可助力确定疾病的原因。论文的第一作者、加州大学伯克利分校博士后研究人员Andrew Lane说:“我们可以花更少的钱来生成这样的向导RNA库,使得有可能可以在较少研究的生物体中进行遗传筛查。”


实时监测细胞


加州大学伯克利分校博士后研究人员Andrew Lane和同事、加州大学伯克利分校的分子和细胞生物学教授Rebecca Heald开发出这一技术旨在实时追踪活细胞中尤其是有丝分裂过程中的染色体。


此外该课题是Rebecca Heald教授主持的一个大型研究项目的组成部分,旨在阐明当生物体从几个细胞生长为具有许多细胞时,是什么控制了细胞核和其他亚细胞元件的大小。他表示,这一技术将使得我们能够给整条染色体涂上颜色,我们可以实时观测它,在细胞周期过程中在细胞核内追踪它,或当它经历发育转变例如在胚胎中时,看看它的大小和结构如何发生改变。


这一新技术利用了标准PCR来生成来自研究人员感兴趣的任何DNA片段,甚至来自整个基因组的大量短DNA。随后在称作PAM的区域中精确剪下这些片段――PAM对于CRISPR结合至关重要。通过利用限制性内切酶切割离PAM端20个碱基对的片段,就生成了CRISPR利用来在基因组中搜查互补位点的精确大小的向导RNA,这些向导RNAs可以很容易地整合到CRISPR-Cas9复合物中,生成成千上万可标记或切割DNA的探针。


加州大学伯克利分校创新基因组计划管理和科学主任Jacob Corn 说:“通过利用基因组自身来作为向导RNA的来源,他们的方法使得几乎所有实验室都能构建出靶向连续区域的文库。这对于基因组成像和某些类型的筛查可能非常有用。”


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