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巧夺天工的RNA结构

细胞是一片迂回曲折的RNA分子海洋。科学家正努力拆解RNA结构的奥秘,并探究它们的重要性。

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当Philip Bevilacqua决定对活体植物细胞内所有的RNA分子形态一探究竟的时候,他遇到了两个难题。首先,自高中毕业后,他再也没有触碰过植物生物学。其次,虽然曾有生物学家试图研究单个RNA分子;但应对成千上万在细胞中游离的分子,显然是更棘手的挑战。


尽管遇到重重困难,作为宾夕法尼亚州立大学柏克校园(Pennsylvania State University in University Park)的一位RNA分子化学家,Bevilacqua并没有放弃。RNA分子在细胞生物学中具有十分重要的调节作用,了解它们的结构,或许能为人类破解其工作机制提供更有利的线索。为此,他恶补了植物解剖学本科课程,并携手植物分子生物学家Sarah Assmann研发一种能进行大规模RNA分析的技术。


2013年11月,Bevilacqua率领他的团队率先描述了活细胞内数千种RNA形态,并向世人展示了拟南芥(Arabidopsis thaliana)细胞内一个真实的RNA世界。同年12月,来自加利福尼亚大学旧金山分校(the University of California, San Francisco)的研究小组利用类似技术报道了酵母和人类细胞的研究成果。北卡罗来纳大学教堂山分校(the University of North Carolina at Chapel Hill, UNC)RNA分子生物学家Alain Laederach指出,这些研究在大规模RNA结构分析方面实现了空前的突破。


过去几十年间,科学家对RNA分子的认识不断深入。早期认为,RNA分子只是一堆像意大利面的柔软条状分子,在DNA和蛋白质之间传递信息。现在,生物学家意识到:RNA不仅有助于蛋白质的合成,也是控制基因活性和修饰其它RNA的重要物质。至少85%的人类基因组被转录成RNA,而RNA分子各种各样的作用,尚待进一步探寻。


此外,仍有一个关键的谜团没有解开:RNA分子复杂多样的结构。DNA具有可预测的双螺旋结构,RNA与DNA不同,RNA是通过单链折叠成环结(loops)、突起(bulges)、假结(pseudo-knots)、锤头样(hammerheads)以及发夹(hairpins)等多种精巧的三维结构。这些结构通过不同的折叠翻转组成不同的功能区域。目前科学家对这些机制的了解非常少。酵母和人类RNA研究领军人物——生物物理学家Jonathan Weissman指出,这正是RNA功能研究中缺失的环节。


最近几年,科学家开始对RNA结构研究发起挑战。Bevilacqua和Weissman等人成功研发出一项新技术,能对细胞内大量RNA结构执行快照。他们发现,活细胞内RNA折叠方式与人工条件下的完全不同。这项研究成果帮助他们破译一部分RNA折叠规则,而这些折叠规则有助于深化对人类变异或疾病的认识——甚至可以对农作物进行改良。


Laederach表示,RNA折叠规则是生物进化中的基本问题,对它的深入研究有助于理解生物的进化历程和这些小分子是如何影响我们的性状及功能。作为一位生物学家,这让他感到非常兴奋。


北卡罗来纳大学教堂山分校(UNC)化学生物学家Kevin Weeks对RNA结构进行了最好的诠释——“RNA顽石”(“RNA rocks”):在进化历程中,其序列或结构很少发生变化。这些序列和结构包括转运RNA和核糖体RNA(两者均涉及蛋白质合成),以及具有酶活性的RNA,也称为核酶。Weeks指出,在RNA世界中,也许这些稳定序列的RNA才是异类。


RNA的世界就如一片未被发现的、变幻莫测的沙漠。加州大学欧文分校(the University of California, Irvine)化学家Rober Spitale表示,我们对于大部分的RNA结构近乎一无所知。RNA分子典型的线性核苷酸链——或者碱基——的形态仅仅存在于模板DNA转录的瞬间。转录完成后,RNA会通过自身核苷酸配对,迅速折叠,进一步扭曲形成三维结构,与蛋白质或其它RNA组合,改变其形态执行不同的任务。


研究RNA结构的大部分技术都利用核苷酸相互结合的特点,或者对某些酶的敏感性:RNA自身配对的区域和保持线性单链的区域会表现出不同的反应。计算机模拟技术也有助于整体结构的模型建立。但这些方法都非常繁琐,而且每次只能对一个分子的一部分进行分析。


五年前,加州斯坦福大学(Stanford University in California)基因组学家Howard Chang联合魏茨曼科学研究学院(the Weizmann Institute of Science in Rehovot, Israel)计算生物学家Eran Segal研发出一项新的技术——RNA结构平行分析技术(parallel analysis of RNA structure, PARS),促进了RNA结构研究的发展。PARS技术利用结构特异性核酸酶(一种可识别切除单链核苷酸的特异序列,另一种识别切除双链或成对的RNA序列),对RNA分子群进行处理。科学家们对片段进行测序和建库,通过分析对比,获得RNA分子的结构。这项技术能够对成百上千的核苷酸片段同时进行测序分析。


RNA结构规则


利用PARS技术,Chang和Segal首次对芽植酿酒酵母(bud-ding yeast Saccharomyces cerevisiae)中3000多个携带蛋白质合成指令的信使RNA(messenger RNAs, mRNAs)进行处理。他们发现一些前所未见的复杂的结构成分,还找到了指导RNA结构的第一条线索:相对于非翻译区的侧翼序列,与蛋白质合成相关的区域通常拥有更多碱基对和更精细的结构。Chang认为,这些结构具有重要的生理意义,因为非翻译区通常需要与调节蛋白相互作用,因此其结构应该更具有开放性和亲和性。


继此之后,于2014年,Chang和Segal对人类细胞mRNA进行了分析。研究生Yue Wan等人利用PARS技术对来自一家三口的血细胞系中20000多个mRNA进行分析,结果在蛋白非编码区发现改变了RNA结构的大约1900个单核苷酸突变。现在要进一步探索的问题是:这些突变对RNA的功能是否造成影响,或者它们只是一些无足轻重的变化。


至少现在已经有一些证据显示这些突变具有意义。2015年5月,Laederach等人报道,一种mRNA的非编码区突变和一种罕见的眼部癌症视网膜母细胞癌有关。在健康人群中,这种mRNA同时具有三种结构,但在两位患者的mRNA中,核苷酸突变迫使RNA分子折叠成单一结构。Laederach认为,这种mRNA折叠上的突变可能与某些疾病以及身高差异等人类特征相关。


PARS技术存在的主要缺陷是所需的核酸内切酶不易穿过细胞膜,因此科学家必须从细胞内提取出RNA,这项操作将破坏其天然结构。理论上,碱基配对能保证RNA分子在细胞内和细胞外有大致相同的性状。但事实上,这种技术会破坏RNA结合蛋白,必将导致RNA结构的改变。


为研究活细胞内RNA结构,许多科学家将他们的关注点转向硫酸二甲酯方法(DMS)。硫酸二甲酯能穿过细胞,在细胞内与未配对的RNA核苷酸——腺嘌呤和胞嘧啶反应。与硫酸二甲酯反应的RNA区域不能逆转录成DNA。科学家将所有RNA逆转录成DNA并经行序列分析,通过缩短的DNA序列确定未配对的RNA区域。


Weissman等人将该方法应用于分析酵母和人类细胞内完全互补的mRNA,对比活细胞内和提取后再折叠状态下RNA的区别。曾参与该项目,现就读于马萨诸塞州剑桥大学怀特黑德研究所(the Whitehead Institute in Cambridge, Massachusetts)的研究生Silvi Rouskin表示,研究初期真的令人十分兴奋,我们无法想象在细胞内和细胞外mRNA的差别。


许多科学家主观推测,在细胞内存在更多的处于折叠状态的RNA,因为互作蛋白能稳定RNA结构。但Weissman等人的研究结果正好相反。他们认为可能因为细胞内的mRNA可以积极地生产蛋白质,并且松散的分子结构更利于蛋白质合成。


Bevilacqua和Assmann利用DMS方法分析拟南芥细胞中的mRNA,意外获得有趣的发现。在干旱状态下被激活的应激反应基因产生的mRNA在细胞内表现出更为松散的状态,其折叠程度远低于计算机理论模型。相反,维持细胞稳定的“管家基因”产生的mRNA与计算机模拟结果非常接近。Bevilacqua等人认为,应激反应产生的mRNA具有松散结构有利于应对外界环境改变,更易改变结构从而调节蛋白质的合成水平。相对而言,管家基因RNA必须保持相对稳定的蛋白质产出水平。Assmann表示,看到这样两极分化的结果真是太神奇了。


但硫酸二甲酯技术仍存在缺陷:DMS只能确定RNA分子中的两种配对的核苷酸,其余部分只能依靠计算机模拟填充。为了弥补这一缺陷,获得RNA中的每一序列,Chang和Spitale研发一项全面分析RNA二级结构的新技术——SHAPE(selective 2'-hydroxyl acylation and profiling experiment)。2015年年初,他们采用这项技术对老鼠胚胎干细胞内19000多个RNA结构进行分析,并发表了研究成果。科学家发现一种能展开mRNA分子结构的常见的化学修饰,并探测了特异结构“信号区”(“signatures”),这些序列可预测控制RNA形状的蛋白结合位点。


一些科学家已经琢磨着将这项技术应用于更多的研究。Assmann和Bevilaxqua正应用这项技术对大米——作为全球最重要的主食之一——进行RNA结构分析,并计划对其它重要农作物开展类似研究。他们希望通过研究发现能巧妙地操控RNA结构的方法,以提高作物的抗逆性和最大产量。


与此同时,Rouskin正着手研究果蝇RNA结构对胚胎发育的影响。她表示,现在我们终于有方法和技术了,可以解答一些之前从不敢提出的问题。


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