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通过单分子测序实现可靠的相位分析

 高通量测序平台产生的读取数据大多比较短,容易丧失遗传学变异的相位信息,但有时候了解这样的信息是至关重要的。怎样才能拼接好这些短序列呢?这是测序分析进入的一个新阶段。

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定相(Phasing)分析旨在确定测序读取彼此是如何连接的。对于人们广泛使用的短读取测序而言,定相分析一直比较困难。一般的定相方法依赖于计算机模拟,主要是与大型数据库或者参考基因组进行比较。也有一些新的高通量测序技术,尝试将单分子分配到标有条码的孔中。不过这些方法都存在这样或那样的缺陷。


瑞典皇家理工学院的Afshin Ahmadian带领研究团队开发了一种新的定相技术。他们开发了包括微珠和条码寡核苷酸的乳化PCR系统,通过单分子测序实现可靠的相位分析。这项研究发表在近期的Nature Communications杂志上。


乳化PCR(emulsion PCR)是一种在乳化溶液中进行的高通量PCR技术。该技术主要是把水相PCR溶液与油混合,建立微小的悬浮水滴乳液。每个液滴都是一个PCR“反应器”,可以实现平行的多重反应体系。


研究人员构建了一个连有微珠的引物文库,微珠上标记了条码序列。随后他们把微珠和单分子DNA放在一起,让目标序列与条码相连。“条码可以帮助我们确定一段序列是处于上游还是下游,”文章共同作者,David Redin说。


研究人员在四种已知基因组的细菌混合物和真实生物学样本中,验证了这一技术的有效性。研究表明,该技术用于短读取的测序平台,可以帮助人们研究复杂的样本,不损失长DNA的相位信息。


虽然乳化PCR需要一些经验和技巧,对初学者来说有一定的挑战。但这是一种比长读取测序还要精确的高通量技术,能够真正达到单分子分辨率,而且不受样品复杂性的影响。这一技术能够准确检测高度类似的序列区域,比如不同细菌的rRNA。


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