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RNA结构组学分析技术

因组、蛋白组和代谢组学研究已经成为常规生物学研究方法,但是对RNA分子进行组学研究依然属于少数实验室的专门技术,主要问题是分析技术的局限。2015年7月23日《自然》有文章专门对这个问题进行了介绍。国际上最早开展这样研究的实验室是用植物开始的,宾夕法尼亚州立大学化学家Philip Bevilacqua2014年在《自然》发表了第一篇RNA组学研究论文,开创了RNA组学研究技术。

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RNA是细胞功能重要调节分子,这些分子结构必然能提供关于功能的重要信息,但生化学家一般都检测和分析RNA单分子,Bevilacqua认为,理解RNA应该对细胞内所有RNA分子进行整体研究,Bevilacqua首先考虑用植物细胞开展研究,虽然他没有任何研究植物生理学的经历,这显得有他过于胆大妄为,但是科学家就应该有一种敢于应对挑战的精神。


为了学习植物细胞知识,Bevilacqua首先恶补了植物解剖学的本科课程。为了解决RNA分析的技术瓶颈,Bevilacqua与植物分子生物学家Sarah Assmann合作,开发出一种能进行大规模RNA分析的技术。


2013年11月,Bevilacqua小组率先在国际上描述了活细胞内数千种RNA形态研究技术,并对植物模式生物拟南芥细胞内RNA形态进行了研究。2013年12月,加州大学旧金山分校采用类似技术报道了酵母和人类细胞的研究结果。北卡罗莱纳大学教堂山分校生物学家Alain Laederach说,这些研究在大规模RNA结构分析方面取得了突破性进。


RNA一直是科学家关注的分子,早期认为RNA只是在DNA和蛋白之间传递遗传信息的分子,生物学家现在知道,人类基因组85%能转录成RNA,但大部分RNA并不会翻译成蛋白质,而是拥有多种多样功能的调节分子,RNA不仅传递蛋白质合成的遗传信息,也是控制基因活性和调节其他RNA功能的重要因素。


不过,科学家对RNA复杂多样的结构并不十分了解。DNA是能预测的双螺旋结构,RNA与DNA不同,是单链折叠成的隆起、假结、头样、发夹等多种多样的复杂三维循环结构。满足不同功能状态的需要,不同折叠能相互转化。科学家对RNA的这些信息了解非常肤浅。生物物理学家Jonathan Weissman说,这正是关于RNA功能研究中最薄弱的环节。


最近几年,科学家开始对RNA结构研究发起挑战。Bevilacqua, Weissman等设计的技术能对细胞内大量RNA结构进行整体解析,初步研究结果发现,活细胞内RNA折叠方式与人工条件下的完全不同。他们提出了一些RNA折叠规则,这些规则可能对理解细胞功能和疾病有帮助。


Laederach说,RNA折叠规则是生物进化中的基本问题,能有助于理解各种RNA表现和功能机制,这是让生物学家最希望了解的内容。北卡大学化学生物学家Kevin Weeks是RNA结构研究专家,他认为进化过程中,RNA是保守的分子,序列和结构进化过程中发生很少变化。不过他指的保守结构和序列的分子是转运RNA、核糖体RNA和核酸酶。Weeks说,稳定序列的RNA不过是海量RNA世界中的个别现象。


加州大学欧文分校化学家Robert Spitale说,我们对大部分RNA的结构几乎一无所知,RNA分子通常有一个线性核苷酸链,但在细胞核内合成后,会通过自身核苷酸配对迅速折叠,然后进一步折叠成复杂三维结构,与蛋白和其他RNA分子发生相互作用时会改变形状。


研究RNA结构的大部分技术利用核苷酸相互结合的特点,或者序列对某些酶的敏感性。计算机模拟技术也有助于整体结构的分析。但是这些方法非常繁琐,一次只能分析一个分子的一部分。


五年前,加州大学基因组学家Howard Chang,联合以色列魏茨曼科学研究所计算生物学家Eran Segal开发了一种RNA结构的PARS技术。PARS技术利用RNA酶将RNA单链部分与双链部分切割。对目标RNA样本进行酶切,制造出两种RNA片段库,然后对两个RNA片段库分别进行序列分析,最后对这些片段进行对接分析,该技术的好处是可批量分析成千上万RNA。原理类似于利用质谱分析小分子原子组成的技术。


利用PARS技术,Chang和Segal对酿酒酵母3000多mRNA进行分析,并发现基因组中存在除非翻译区序列外更多复杂的奇怪结构成分。这些结构有重要生理意义,因为非翻译区通常需要与调节性蛋白相互作用。2014年,Yue Wan利用PARS技术对来自一家三口的血液细胞的20,000多个mRNA进行分析,发现大约1900个非编码单链变异区。


2015年5月,Laederach小组报道,一种mRNA非翻译区变异和一种罕见眼部癌症视网膜母细胞瘤有关。健康人的该mRNA有三种结构,但视网膜母细胞瘤只有两种。mRNA核苷酸结构变异能让该分子形成单链结构。Laederach认为,这种mRNA核苷酸结构变异可能与某些疾病和身高差异有密切关系。


PARS的主要缺陷是某些核酸内切酶不容易穿过细胞膜,因此只能将RNA从细胞内抽提出来,这将破坏细胞的天然结构。理论上RNA在细胞内和细胞外应该有大致相同的形状,但事实上这种操作会破坏结合RNA的蛋白,导致RNA在细胞内外结构上的差异。


为研究活体RNA结构,许多科学家采用硫酸二甲酯方法,硫酸二甲酯能够结合未折叠的RNA链,不能结合折叠的RNA链。硫酸二甲酯也能进入细胞内,在细胞内与未折叠的RNA链中四种碱基中的腺嘌呤和胞嘧啶反应。然后将RNA逆转录成DNA并进行序列分析。那些结合硫酸二甲酯的核苷酸不能被逆转录,通过分析缩短的DNA序列确定未折叠RNA链。


Weissman等将该方法应用于酵母和人类细胞全部mRNA分析,比较了活细胞和细胞破碎提取后再折叠RNA。参与该项目的Silvi Rouskin说,研究可对比活体和离体mRNA的差异,这非常有意思。许多科学家主观估计,细胞内RNA折叠更明显,因为细胞内有许多蛋白质能稳定RNA结构。Weissman的研究结果正好相反。他们分析可能是因为细胞内mRNA翻译成蛋白质时需要保持比较松散的结构。


使用硫酸二甲酯技术,Bevilacqua和Assmann分析拟南芥细胞mRNA后获得了奇怪的结果。一些在干旱情况下被激活的应激反应基因的mRNA在细胞内折叠程度远低于理论模拟。相反,维持细胞稳定的管家基因折叠程度与计算机模拟更接近。Bevilacqua等认为,应激反应mRNA折叠少是为提高相关基因翻译效率,应对外界环境改变,而管家基因mRNA必须保持稳定的表达。


硫酸二甲酯技术的只能确定一类核苷酸对,其余部分只能依靠计算机模拟填充。为获得细胞内RNA每一序列,Chang和Spitale使用改进的结构探针技术SHAPE6,对老鼠胚胎干细胞内19000个RNA结构进行整体分析(2015)。发现了的一种能促进mRNA分子伸展的常见化学修饰,对这些修饰部位分析可预测蛋白质结合和控制RNA形状的独特序列。


一些研究人员已经考虑将这些技术用于更多细胞。Assmann 和 Bevilacqua正在用这些技术对大米细胞RNA进行分析,并计划对其他农作物开展类似研究。他们希望通过这种研究,寻找到能操作RNA形状的方法,以作为提高作物的抗逆能力和产品产量。Rouskin正在研究果蝇RNA结构对胚胎发育的影响。


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