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克隆技术对对碰:经典方法 vs. 新晋神器

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自1972年建立以来,克隆技术已成为实验室中一种必不可少的方法,无论是基因表达分析,还是合成生物学。酶切、连接,这种经典曲目大家都再熟悉不过了。当然,即使大爱经典,也不要错过一些新的克隆技术,它们有望带来更好的速度、准确性和灵活性。

经典曲目


研究人员克隆DNA的理由有很多,比如交换基因调控区域,添加蛋白质标签,或破坏基因功能,使细胞对抗生素敏感。一般来说,他们利用限制性内切酶,在特定位置(多克隆位点,MCS)线性化载体。


同时,插入片段也经过特殊设计,使其末端与载体末端互补。之后,将载体和插入片段连接在一起,并转化大肠杆菌,筛选阳性的重组克隆。“许多人仍在使用经典的酶切­连接方法,”NEB DNA酶部门的科技总监Tom Evans谈道。


基本原理虽然没有变,但开展实验所用的试剂已经有了许多改进,包括瞬时连接的连接酶、速度更快的限制性内切酶、星号活性更低的限制性内切酶,以及全面适用的缓冲液。“过去,双酶切需要寻找适用的缓冲液。如今不需要了,几乎所有双酶切都能使用NEB的CutSmart缓冲液,”他解释道。


酶切­连接的方式相对而言比较便宜,也是最简单的技术,可将不同大小的片段插入质粒。不过,对于很多应用而言,它的步骤更多,所花的时间也更长,从引物设计开始就需要精心考虑,而插入片段可能还需要磷酸酶处理。


新浪潮


最近,许多技术开始利用一组酶进行单管克隆。Clontech的In­Fusion系统就是其中一个。与经典克隆相似,这也是从线性载体和线性插入片段开始的,插入片段的末端与载体同源。不过,酶切位点可随意选择,而插入片段通常是由PCR创建的,其引物两端带有线性化的载体两端的15个碱基,Clontech的产品营销经理Suvarna Gandlur谈道。


这些专利的预混液包含一种核酸外切酶,它能消化插入片段的单链,让插入片段末端与载体末端以定向方式配对。一些预混液包含连接酶,而其他则依赖细菌的内源酶来执行这一步。


这样的系统还有Gibson Assembly®(根据它的发明者Daniel Gibson命名)、赛默飞世尔的GeneArt® Seamless Cloning and Assembly以及NEB的NEBuilder® HiFi DNA Assembly。它们最大的优点就是能够同时在单管中组装多个不同的片段。


操作过程也非常快速。据System Biosciences(SBI)的网站上介绍,Cold Fusion Cloning Kit的整个过程只需要20分钟。对于研究人员而言,节省的时间也不单是反应时间,特别是在组装复杂的载体时。“利用一些老派的方法,您可能需要几个月才能实现四个片段或四个基因的表达,”SBI的资深科学家Fangting Wu指出。“有了这个,您只需要组装四个PCR产物,三天内就能获得最终的重组子,不仅正确,而且是理想的方向。”


几乎所有基于同源重组的试剂盒都声称有着非常高的效率。Gandlur指出,含有正确克隆的菌落百分比比平板上的菌落总数要重要得多。


Wu指出,所有保真性都来自PCR反应,并建议客户使用高保真的DNA聚合酶来扩增他们的产物。


摇滚乐


Evans指出,实际上还有大量的系统可以组装DNA。


其中之一就是Life Technologies的Gateway克隆系统,它基于λ噬菌体,允许插入DNA在Gateway载体之间穿梭。这反过来也利于研究界之间的轻松共享。赛默飞世尔目前提供MultiSite Gateway试剂盒,能在单个载体中组装两个、三个或四个DNA片段。


同样,NEB的Golden Gate Assembly也利用位点特异性识别来组装。Evans表示,它在TALEN和CRISPR研究界很流行。“这是Golden Gate真正出众的地方。您可以从冰箱中取出质粒,把它们放在一起,加入Golden Gate预混液,就能实现组装。您不必通过PCR。”


这两种方法都需要限制性内切酶消化,才能产生重组体。Gateway系统与经典克隆一样,需要精心设计,才能避免留下“疤痕”。Golden Gate则略有不同,利用IIS型限制性内切酶来切割识别位点外侧的DNA。消化所产生的片段将有着突出部分,能以“无缝”的方式形成适当的重组体。尽管以传统方法为基础,但这些系统为研究人员提供了一个强大而高效的克隆方案。


“所有的技术都有一定的学习曲线——即使是经典的酶切克隆,”Evans指出。他建议利用在线工具来帮助设计重组体和引物,特别是文献中开发出的系统知识。按照这些提示,也许您很快就能获得梦寐以求的阳性克隆。



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