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CRISPR:基因编辑技术的“搅局者”,将给生命科学带来巨变

3年前,美国加利福尼亚州旧金山市Gladstone研究所(Gladstone Institutes in San Francisco, California)的遗传学家Bruce Conklin想到了一个能够改变他们实验室工作流程的新办法。Conklin的研究方向是DNA变异与人类疾病的关系,但是他感觉他们的实验方法和流程非常的复杂,而且不管用。

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比如他们在对患者的细胞进行研究时就很难确定哪些序列与疾病有关,哪些信号是背景噪声。往细胞里引入一个突变也是既费时、费力,又费钱的一项大工程。“改造一个基因就是我们一个研究生的课题。”Conklin介绍说。


2012年,Conklin看到了一篇刚刚发表的,介绍CRISPR技术的文章。使用这种技术,可以快速对DNA进行改造,而且几乎不受物种的限制,当然也能够对人类的DNA进行遗传学改造。Conklin很快就放弃了他们之前的研究策略——构造病理模型,转向了CRISPR这种新技术。Conklin等人正在对一系列与心脏疾病有关的基因进行改造,他兴奋地指出,CRISPR技术给我们带来了彻底的改变。


很多人都有着与Conklin一样的感受,大家都认为CRISPR技术正在给生物医学研究带来一场巨大的改变。与其它基因编辑技术(gene-editing methods)不同的是,CRISPR技术更便宜、更便捷,所以出现之后立即席卷全球。科研人员们希望用这种技术对人类的基因进行改造,以达到治疗疾病的目的,同时也希望使用这种技术创造出抗病、抗虫等抵抗力更强的植物,以及其它很多新的用途。


美国纽约康奈尔大学(Cornell University in Ithaca, New York)的遗传学家John Schimenti表示,自从踏入科学的殿堂以来,他亲身经历过两大科技进步,那就是PCR技术和CRISPR技术。PCR技术是诞生于1985年的一项基因扩增技术,它给遗传工程学带来了革命性的改变。CRISPR技术也和PCR技术一样,正在从方方面面影响着生命科学的发展。


虽然CRISPR技术有着诸多的益处,但是也有一些科学家对此表示担忧。他们担心科技发展太快,而与此相关的伦理和安全问题却没能跟上,所以有可能带来问题。


比如今年4月,CRISPR技术就受到了公众的关注,因为有科学家使用这种技术对人体胚胎进行了改造。这个经过改造的胚胎是一个不能发育为完整生命体的胚胎,但是尽管如此,该消息还是引起了热烈的讨论,讨论的焦点就是究竟能否使用CRISPR技术对人类基因组进行可遗传的改造。除此之外,还有一些其它的担忧。


比如有些科学家就希望看到更多的研究,以验证CRISPR技术是否会给基因组带来非目的性的、其它的、有可能存在风险的改变。再比如美国加利福尼州斯坦福大学(Stanford University in California)的系统生物学家Stanley Qi就认为,CRISPR技术的门槛非常低,任何实验室都能够掌握这项技术,既不需要耗费巨资购置实验设备,也不需要对实验人员进行长达数年的培训。所以我们应该好好想想,怎样才能更好地使用这项新技术。


科研革命


一直以来,生物学家们都能够应用各种分子生物学技术,对基因组进行编辑操作。大概在十年前,出现了锌指核酸酶(zinc finger nucleases),它能够以很高的准确度和效率进行基因组编辑,所以科研人员也为此兴奋了好一阵。但是据美国马萨诸塞州布兰迪斯大学的分子生物学家James Haber介绍,动辄5000美元甚至更高的价格却让人难以接近,而且还需要定制与靶标相适应的锌指核酸酶,非常麻烦。


而CRISPR技术就不一样了,该技术只需要使用Cas9酶,能够识别靶标DNA的向导RNA(guide RNA)就足够了。CRISPR技术能够对DNA序列进行编辑,起到破坏基因,或者插入外源序列的作用。科研人员们需要做的往往只是订购一段向导RNA,因为其他的实验材料都是通用的,而总成本也才只需要30美元。据Haber介绍,这种特点使得每一个人都能够用上CRISPR技术,这就是一场巨大的科技革命。


CRISPR技术问世之后立即取代了锌指核酸酶和其它一些基因组编辑技术。对于某些人来说,这意味着他们之前花费了很多年才掌握的技术一下子变得毫无价值,所以不得不放弃那些技术。


英国Wellcome基金会Sanger研究所的遗传学家Bill Skarnes就说道:“我很沮丧,但我同时也感到非常兴奋。”在Skarnes的科研生涯当中,有绝大部分时间都使用的是上世纪80年代中期发展起来的一种技术,即在胚胎干细胞里插入一段DNA,然后用这些细胞培育出转基因小鼠的技术。该技术已经成为了实验室里的主流技术,但它确实费时费力,而且价格昂贵。相比之下,CRISPR技术就要省事得多,Skarnes的实验室也在两年前开始使用CRISPR技术。


科研人员在科研工作当中一直都非常依赖果蝇和小鼠等模式生物,有一部分原因就是因为我们只能够对这些模式生物进行遗传学改造。现在有了CRISPR技术,我们就能够对更多的生物进行改造。比如在今年4月,美国马萨诸塞州坎布里奇Whitehead生物医学研究所的科研人员就使用CRISPR技术对白色念珠菌(Candida albicans)这种对免疫力低下人群致命的真菌进行了研究,要知道在过去是很难在实验室里对这种生物进行遗传学操作的。美国加州大学伯克利分校的CRISPR技术先驱Jennifer Doudna一直在更新她的CRISPR技术适用范围表。到目前为止,她的这份表格里已经登记了30多种物种,全都是可以用CRISPR技术进行改造的,其中就包括致病的锥虫(trypanosomes)可以用来制备生物燃料的酵母。


不过CRISPR技术这种飞速的发展也带来了一定的问题。美国加州大学旧金山分校(University of California, San Francisco)的生物物理学家Bo Huang就表示,大家都还没有足够的时间来确定整个技术系统的基本参数。大家都认为,只要这种技术管用,我们就没必要知道它为什么管用,以及这种技术的工作原理。这就意味着科研人员需要时不时地面对一点干扰信号。Huang等人在实验室花了两个月的时间,想将CRISPR技术引入成像研究工作当中。他们认为,如果能够更清楚地了解应该如何优化向导RNA的设计(即基础原理),他们是不会在前面浪费这两个月的时间的。


但是总体而言,科研人员们都愿意接受这种“无知”的代价,因为CRISPR技术实在是太好用了。不过Doudna则更关注安全问题。她的担忧源自2014年召开的一场会议,当时她参加了一个博士后的工作分享,这名科研人员构建了一个携带有小鼠CRISPR组份的病毒。小鼠吸入这种病毒之后,病毒中携带的CRISPR组份就开始表达并发挥作用,对小鼠的基因组进行了改造,成功地构建出人肺癌小鼠动物模型。当时Doudna就感到了一阵恐惧,因为这个病毒携带的向导RNA如果出了一点问题,那可能就不是让小鼠患上肺癌,而是让我们人类患上肺癌了。Doudna说道:“让学生开展这种实验可真够吓人的。我们一定得让大家知道,应该用CRISPR技术来干些什么。”


Andrea Ventura是美国纽约纪念斯隆-凯特林癌症中心(Memorial Sloan Kettering Cancer Center in New York)的一名肿瘤研究人员,同时也是上述小鼠实验工作的主要负责人,他表示,他们实验室非常认真、仔细地考虑过了整个实验的安全性问题,他们设计的向导RNA是特异性、专一性针对小鼠基因组的,而且病毒也都是失活的,不能进行复制。Ventura也认为应该对这项研究的远期风险进行预判和评估,他说道:“虽然我们设计的向导RNA不会影响人体的DNA,但是谁知道呢。虽然不太可能,但这个问题还是值得考虑。”


用编辑的方法删去疾病


去年,美国麻省理工学院(Massachusetts Institute of Technology in Cambridge)的生物工程师Daniel Anderson等人使用CRISPR技术在小鼠动物实验中成功地纠正了一种与人高酪胺酸血症(tyrosinaemia)相关的遗传突变。这也是世界上首次使用CRISPR技术在成年动物实验中纠正了致病突变,这预示着我们在使用CRISPR技术进行基因治疗的道路上又向前迈进了一大步。


CRISPR技术能够加快基因治疗的消息也让科研界和生物技术界兴奋不已。不过虽然这种技术的潜力很大,但Anderson的研究也向我们展现了,现实与理想的差距有多远。为了将Cas9酶和向导RNA注入小鼠的靶器官肝脏,Anderson等人往小鼠的血管中注入了大量的液体,如果是对于人体,这种方法根本就是行不通的。而且在他们的实验中,只有0.4%的细胞里的致病突变得到了纠正,这对于治疗疾病来说是远远不够的。


近两年来,有很多公司都加入了用CRISPR技术开展基因治疗的行列。据Anderson等人估计,最快将在一两年内会有产品进入临床试验阶段。这些实验可能会将CRISPR药物直接注入靶器官,比如眼睛等,也可能会植入取自患者自身的细胞里,然后将这些经过改造的细胞回输到患者体内。比如对患者的造血干细胞进行改造,来治疗镰状红细胞病(sickle-cell disease)或β地中海贫血(β-thalassaemia)等疾病。不过我们可能很难将CRISPR药物直接注入其它靶器官,但科研人员们希望,在未来的某一天,能够使用这种技术解决各种各样的遗传疾病。


很多科学家都认为,我们还需要开展更多的工作,保证CRISPR技术的安全和功效。比如增强该技术的基因组编辑能力,但同时也不能够在非目标区域内引入改变,避免对人体健康造成影响。Haber表示,这些酶如果在目标区域之外发挥了作用,就会带来一系列的后果。如果你想替代某人干细胞内的镰刀状细胞基因,那么你就该先问问,‘会不会同时在它的基因组内造成其它的影响和改变呢?’”


Keith Joung在美国麻省总医院(Massachusetts General Hospital in Boston)从事基因编辑研究,他也一直在开发能够找到Cas9脱靶切割位点的方法。据Joung介绍,这种脱靶切割发生的几率在每种细胞之间都大不一样,甚至不同的序列都有所不同,他们实验室和其他几个实验室观察到的脱靶位点突变率的范围从0.1%一直到超过60%。即便是极低概率的事件也有可能带来潜在的危害,比如就有可能加快细胞的生长和增殖,形成肿瘤。


美国马萨诸塞州坎布里奇专门从事CRISPR基因治疗的Editas公司的CEO Katrine Bosley认为,既然还存在这么多的问题,所以就更加应该对CRISPR技术进行严格的监控。Bosley在新技术商业化方面有着丰富的经验,据她介绍,在新技术商业化推广的过程中,最困难的一步就是说服其他人相信这种新技术有作用。她说道:“关于CRISPR技术,几乎全是它的各种好处,大家都非常激动,也都给予了很大的支持,但是是否真能让大家的期望变成现实,关于这个问题我们还得冷静一点。”


CRISPR技术在农业方面的应用


就在Anderson等人将目光锁定在如何利用CRISPR技术改造人体细胞的时候,另外一部分人则瞄准了庄稼和家畜。在基因编辑技术出现之前,我们的做法就是往这些农牧业生产对象的基因组里“随意地”插入一个基因(不能确定并控制基因插入的位置),然后利用一段来自细菌、病毒或其它物种的调控序列,促进该外源基因的表达。


但是这种遗传学改造的效率是非常低的,也常常会引起反对人士的抗议,这帮人不愿意将不同物种的DNA混在一起,他们担心这种随意的插入会影响被插入基因组里其它基因的功能。此外,这种经过遗传学改造的农作物的商业化上市过程也非常复杂,而且费用不菲,所以也仅限于对玉米或大豆这种需求量非常大的作物进行遗传学改造。


有了CRISPR技术之后,这种现状将得到很大的改变,由于CRISPR技术具有低成本和易用性的特点,所以能够对生产规模很小的特殊农作物,包括动物进行遗传学改造。近几年来,科研人员们已经使用CRISPR技术对袖珍猪(petite pigs)进行了遗传学改造,也开发出了抗病的小麦和水稻。他们也正在开发无角的牛、抗病的山羊和富含维生素的甜橙等新品种。Doudna估计她的CRISPR技术适用物种清单还会进一步扩充。她表示,现在大家对商业价值没那么大,但是从研究的角度来说很有意思的植物(或家庭果园植物)里的信号通路进行CRISPR实验或改造的兴趣越来越大。


CRISPR技术能够对DNA进行精准编辑的能力有利于我们对DNA进行精确的改造,但是这也同时让监管者和农民们难以区分哪些是之前就已经存在的人工改造品种。在美国北卡罗来纳州立大学(North Carolina State University in Raleigh)从事科学政策研究的Jennifer Kuzma就表示,由于有了基因编辑技术,我们就无法做到对人工改造产品进行真正意义上的追踪,我们将很难辨别哪些物种是经过人工改造的,哪些物种是天然突变的。


“我们很难辨别哪些物种是经过人工改造的,哪些物种是天然突变的。”这也就给我们敲响了警钟,也给试图出台基因编辑动植物管理条例的国家出了一道难题。比如FDA就已经批准人工遗传学改造的动物可供人类食(使)用,但他们还没有就基因编辑动物的使用发表相关意见。


根据现有的管理规定,并非所有接受过基因组编辑的农作物都需要接受美国农业部(US Department of Agriculture)的监管(Nature 500, 389–390; 2013)。不过今年5月,美国农业部开始向各方咨询,该如何改进他们的人工遗传学改造农作物管理办法,美国农业部的这一举动也释放出一种信号,标明他们在面对CRISPR等新技术的当下,也在重新审视现有的监管方案。据Kuzma介绍,窗子已经打开了一条缝,不过还没人知道里面会透出点什么。但是无论如何,窗户被打开本身就已经让人很兴奋了。


CRISPR技术在生态系统方面的应用


除了农业之外,科研人员们也在考虑如何将CRISPR技术应用于野外的生物。大家的注意力主要都集中在gene drive这项新策略上。所谓gene drive就是能够在一个种群内快速传播人工编辑基因的方法。目前该技术虽然还处于起步阶段,但是该技术却有着很多的用途,比如可以快速清除携带致病原的蚊虫或蜱、螨,消灭侵入性植物,或让美国农民们异常头痛的藜的耐除草剂基因。


通常来说,一个遗传变异往往需要很长的时间才能够在一个种群内传播开。这是因为在繁殖时,遗传突变只能够传到子代两条染色体中的一条染色体上。但是使用gene drive技术就可以让每一个子代体内通过CRISPR技术在一条染色体上引入的突变自我复制,于是能够让几乎所有的子代全都携带上这种人工改造过的突变,形成指数级增长。一个蚊子在一个夏季之内,就可以让种群内所有的蚊子全都携带上同一种突变。如果这种突变是能够减少蚊虫子代数量的突变,那么该种群都会灭绝,它们体内携带的疟原虫当然也就被一并清除掉了。


不过还是有很多科研人员对于这种影响整个种群的做法表示了忧虑,因为这样做不知道会给整个生态系统带来什么样的改变和结果,比如可能会出现其它害虫,或者会影响食物链上层的物种等。大家还担心,随着时间的流逝,向导RNA在将来可能还会对另外一段DNA序列发挥作用,并且在种群内传播开,带来不可预知的影响和结果。


美国哈佛大学医学院(Harvard Medical School in Boston)的生物工程师George Church认为,必须得有相当高的性价比,否则就不应该采用这种手段,因为这是不可逆的操作,风险太大,而且很难预测会对其它的物种带来什么样的影响。”2014年的4月,Church和一帮科学家及政策专家联合在《科学》(Science)杂志上发表了一篇评论文章,他们提醒科研人员们应该注意种群改造的风险,而且提供了一些参考意见,指导大家应该如何防范gene drives实验意外泄露的问题。


那时看来,gene drives似乎离我们还很遥远。但是一年的时间都不到,美国加州大学圣地亚哥分校(University of California, San Diego)的发育生物学家Ethan Bier和他的学生Valentino Gantz就发表了文章,报道了他们在果蝇种群中的gene drives研究工作。


Bier和Gantz使用了一种里外共有3层的盒子来饲养实验果蝇,而且他们实验室的安全级别达到了用来研究感染有疟原虫的蚊子的安全级别。但是他们并没有完全遵照Church等人的安全指南,比如就没有设计一种能够逆转整个遗传学改变的方案。Bier表示,他们只是在进行原理验证试验(proof-of-principle experiments),看看这种技术是否有效,还没有开展更加复杂的后续研究工作。


对于Church和其他人而言,这就是一个非常明确的警告,表明民主化使用CRISPR技术进行基因组编辑会带来意想不到的、非意愿的结果。


Church等人那份评论的主要作者,美国麻省理工学院的政治学家Kenneth Oye表示,国家管理当局和国际社会有必要站出来,真的非常有必要。我们需要采取更多的行动。美国国家研究委员会(US National Research Council)已经成立了一个小组,专门讨论gene drives问题,其他高级别的讨论也都在进行之中。不过Oye担心科技正在飞速发展之中,也许只有在发生了备受关注的gene-drive泄露事件之后才会做出管理政策上的改变。


这种问题不是非黑即白的问题。美国德州农工大学(Texas A&M University in College Station)的昆虫生态学家Micky Eubanks表示,他第一次接触到gene-drive这个概念时就被吓了一跳。据Eubanks介绍,当他第一次听到这个概念时的第一反应就是‘我的天呐,这太可怕了,太疯狂了’。但是当你再想想,尤其是与我们已经,并且在继续对自然环境造成的改变对比一下,你就会发现,gene-drive也不过就是大海里的一个小水珠。


很多科研人员都会把CRISPR技术与其它那些曾经给我们带来过希望和失望的新技术相提并论。美国宾夕法尼亚大学(University of Pennsylvania in Philadelphia)的医学遗传学家James Wilson在上世纪90年代时就身处基因治疗大热潮的核心,直到临床试验失败,一名年轻人丧生之后,这股热潮才慢慢冷却下来,直到最近才又有所回暖。


Wilson表示,CRISPR技术还非常年轻,我们可能还需要好多年的时间才能够真正认识该技术的潜力。“CRISPR技术正处在爆炸式增长的阶段,相关的一切还都在发酵、酝酿之中。”Wilson这样说道。


Wilson自己也被CRISPR技术给闪了一下。据他介绍,他在一开始也对该技术持怀疑态度,直到他们实验室开始使用这项技术。他表示,CRISPR技术最终一定会在临床治疗领域发挥重要的作用,这种技术真的非常伟大。


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