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我科学家用CRISPR实现大豆定向诱变

 基因组编辑是分析基因功能、基因治疗与作物改良的重要工具。近年来,已经开发出三种基因组编辑技术,分别依靠锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样核酸酶(TALENs)和集群定期间隔短回文重复(CRISPR)/ CRISPR相关蛋白(Cas)系统。

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所有这三种方法都可诱导靶基因组DNA中的双链断裂(DSBs),然后通过非同源末端连接(NHEJ)和同源重组(HR)进行修复。ZFNs和TALENs可过蛋白质与DNA之间的相互作用,靶定基因组,而通过CRISPR-Cas系统的基因组DNA编辑,是基于短的RNA-DNA碱基配对。与ZFNs和TALENs相比,用CRISPR-Cas系统进行基因组编辑更简单、更快和更有效。因此,在过去两年里,CRISPR-Cas系统已被广泛应用于真核细胞的基因组编辑。


在植物中,CRISPR-Cas9系统已被成功应用于多个物种,包括拟南芥、烟草、水稻、高粱、小麦、玉米、柑橘和苔类植物。在这些应用中,Cas9是由花椰菜花叶病毒(CaMV)35s启动子或基因特异性启动子表达的。一个核定位信号(NLS)序列融合到Cas9基因中,将CAS9传递到基因组核中。为了设计sgRNA,研究人员将靶DNA中PAM后面的20 bp序列选作sgRNA“种子区”。


这些20 bp的sgRNA种子区富含在植物基因组中,超过90%的水稻基因含有一段特定的sgRNA种子区。目前,科学家们已经开发了几个软件程序,来识别靶向特异性sgRNA种子区。RNA聚合酶III启动子(如U6和U3)通常用来表达sgRNA。CaMV 35s启动子,也用来表达没有额外核苷酸的sgRNA。几种不同的sgRNAs可以在一个单一的CRISPR-Cas9系统内共同表达,以同时靶定多个DNA位点。


在植物中,CRISPR-Cas9诱导的DNA双链断裂,可以通过HR或NHEJ修复,后者主要负责基因组插入或缺失(indel)突变。CRISPR-Cas9系统是一种高效的工具,可获得具有高突变频率的靶向突变转基因植物。双等位基因突变也已在T0代转基因植株中被高频率地观察到。CRISPR-Cas9系统是推动功能基因组学研究发展的一种强大工具。定向突变也被应用于作物改良。在小麦中,CRISPR-Cas9系统诱导的TaMLO突变植株,显示出对白粉病的广谱抗病性。


过去的二十年中,诱变在功能基因组研究中扮演一个重要的角色。定向诱变是功能基因组学研究的一个有效工具。虽然最近几年ZFNs已经应用于大豆的定向诱变,但是实验难度、高成本和较低功效,限制了它的应用。


在这项研究中,研究人员成功使用CRISPR-Cas9系统在大豆中实现定向诱变,突变效率在14.7%到20.2%之间。他们预测了大豆中更多11个U6基因,然后分别利用大豆U6-10和拟南芥U6-26启动子,构建了两个载体(pcas9-gmu6-sgrna和pcas9-atu6-sgrna),以生产合成引导性RNA(sgRNAs),进行靶向基因诱变。三个基因——glyma06g14180、glyma08g02290和glyma12g37050,被选定为靶标。


研究人员在大豆原生质体中分别检测了这三个基因的突变。然后,通过发根土壤杆菌感染,将这些载体转化为大豆毛状根,从而产生高效的靶基因编辑。研究人员在转基因毛状根中检测到了glyma08g02290和glyma06g14180的双等位基因突变。


使用CRISPR-Cas9系统时,脱靶活性是很常见的。在这项研究中,研究人员检测了Glyma06g14180和Glyma12g37050基因突变的脱靶活性。脱靶活性将提高大豆饱和基因突变库构建的突变效率。利用CRISPR-Cas9系统的定向诱变,可促进大豆的功能基因组研究,尤其是与根和结节相关的基因。


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