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细菌的革兰氏染色

一、原理及目的


原理:

G﹢菌:细胞壁厚,肽聚糖网状分子形成一种透性障,当乙醇脱色时,肽聚糖脱水而孔障缩小,故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。呈紫色。

Gˉ菌:肽聚糖层薄,交联松散,乙醇脱色不能使其结构收缩,其脂含量高,乙醇将脂溶解,缝隙加大,结晶紫-碘复合物溶出细胞壁,沙黄复染后呈红色。

目的:初步掌握细菌涂片方法及革兰氏染色法步骤。

内容:1.制作细菌染色装片。

  2.进行革兰氏染色法操作。


二、实验材料和用具


苏云金杆菌或金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(E.coli)菌液,待测菌菌液1~2种。

革兰氏染色液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石炭酸复红液等)、香柏油、二甲苯;显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、吸水纸、试管、小滴管、酒精灯。


三、操作步骤


(一)制片

1.涂菌   用无菌操作方法从试管中沾取菌液一环,用接种环在洁净无脂的载玻片上做一薄而均匀、直径约lcm的菌膜。涂菌后将接种环火焰灭菌。

2.干燥   于空气中自然干燥。亦可把玻片置于火焰上部略加温加速干燥(温度不宜过高)。

3.固定   目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上,便于染料着色,常用加热法,即将细菌涂片膜向上,通过火焰3次,以热而不烫为宜,防止菌体烧焦、变形。此制片可用于染色。

(二)染色

l.初染   于制片上滴加结晶紫染液,染lmin后,用水洗去剩余染料。

2.媒染   滴加卢戈氏碘液,lmin后水洗。

3.脱色   滴加95%乙醇脱色,摇动玻片至紫色不再为乙醇脱退为止 (根据涂片之厚薄需时30s至lmin),水洗。

4.复染   滴加石炭酸复红液复染lmin,水洗。

5.滤纸吸干,油镜镜检。

(三)结果

革兰氏阳性菌染成蓝紫色,革兰氏阴性菌染成淡红色。

(四)检测未知菌

用以上方法对未知菌进行革兰氏染色,并绘图、记录染色结果。


四、注意事项


1. 涂片务求均匀,切忌过厚。

2.在染色过程中,不可使染液干涸。

3.脱色时间十分重要,过长,则脱色过度,会使阳性菌被染成阴性菌;脱色不够,则会使阴性菌被染成阳性菌。

4.老龄菌因体内核酸减少,会便阳性菌被染成阴性菌,故不能选用。


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