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消毒与灭菌

一、干热灭菌


(一)目的要求

1.了解干热灭菌的原理和应用范围。

2.学习干热灭菌的操作技术。

(二)基本原理

干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关,在菌体受热时,当环境和细胞内含水量越大,则蛋白蛋凝固就越快,反之含水量越少,凝固缓慢。因此,与湿热灭菌相比,干热灭菌所需温度要高(160~170℃),时间要长(1~2h),但干热灭菌温度不能超过180℃,否则,包器皿的纸或棉塞就会烧焦,甚至引起燃烧。

(三)器材

培养皿、试管、吸管、电烘箱等。

(四)操作步骤

1.装入待灭菌物品

将包好的待灭菌物品(培养皿、试管,吸管等)放入电烘箱内,关好箱门。

物品不要摆得太挤,以免妨碍空气流通,灭菌物品不要接触电烘箱内壁的铁板,以防包装纸烤焦起火。

2.升温

接通电源,拨动开关,打开电烘箱排气孔,旋动恒温调节器至绿灯亮,让温度逐渐上升。当温度升至100℃时,关闭排气孔。在升温过程中,如果红灯熄灭,绿灯亮,表示箱内停止加温,此时如果还未达到所需的160—170℃温度,则需转动调节器使红灯再亮,如此反复调节,直至达到所需温度。

3.恒温

当温度升达到160~170℃时,恒温调节器会自动控制调节温度,保持此温度2h。

干热火菌过程。严防恒温调节的自动控制失灵而造成安全事故。

4.降温

切断电源、自然降温。

5.开箱取物

待电烘箱内温度降到70℃以下后,打开箱门,取出灭菌物品。

电烘箱内温度末降到70℃,切勿自行打开箱门以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂。


二  高压蒸气灭菌


(一)目的要求

1.了解高压蒸气灭菌的基本原理及应用范围。

2.学习高压蒸气灭菌的操作方法。

(二)基本原理

高压蒸气灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内,通过加热,使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸气。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽,然后关闭排气阀,继续加热,此时由于蒸气不能溢出,而增加了灭菌锅内的压力,从而使沸点增高,得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。

在同一温度下,湿热的杀菌效力比干热大。其原因有三:一是湿热中细菌菌体吸收水分,蛋白质较易凝固,因蛋白质含水量增加,所需凝固温度降低(表2—1),二是湿热的穿透力比干热大(表2—2),三是湿热的蒸气有潜热存在。1g水在100℃时,由气态变为液态时可放出2.26kJ(千焦)的热量。这种潜热,能迅速提高被灭菌物体的温度,从而增加灭菌效力。

表2—1  蛋白质含水量与凝固所需温度的关系

卵白蛋白含水量/%

30分钟内凝固所需温度/℃

50

56

25

74~80

18

80~90

6

145

0

160~170

在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时,灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要,因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压,所以,当水蒸气中含有空气时,在同一压力下,含空气蒸气的温度低于饱和蒸气的温度。灭菌锅内留有不同分量空气时,压力与温度的关系见(表2—3)

 

表2-2 干热温热穿透力及灭菌效果比较

温度/℃

时间/h

透过布层的温度/℃

灭菌

20层

10层

100层

干热130-140

4

86

72

70.5

不完全

湿热105.3

3

101

101

101

完全

 

表2—3  灭菌锅留有不同分量空气时,压力与温度的关系

压力数

全部空气排出时的温度/℃

2/3空气排出时的温度/℃

1/2空气排出时的温度/℃

1/3空气排出时的温度/℃

空气全不排出时的温度/℃

Mpa

Kg/cm2

Ib/in2

0.03

0.35

5

108.8

100

94

90

72

0.07

0.70

10

115.6

109

105

100

90

0.10

10.5

15

121.3

115

112

109

100

0.14

1.40

20

126.2

121

118

115

109

0.17

1.75

25

130.0

126

124

121

115

0.21

2.10

30

134.6

130

128

126

121

现在法定压力单位己不用磅和kg/cm2表示,而是用Pa或bar表示,其换算关系为:1kg/cm2=98066.5Pa;1Ib/in2=6894.76Pa.

一般培养基用0.1Mpa(相当于15 Ib/in2或1.05kg/cm2),121.5℃,15~30min可达到彻底灭菌的目的。灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变。例如含糖培养基用0.06Mpa(8Ib/in2或0.59kg/cm2)112.6℃灭菌,然后以无菌操作手续加入灭菌的糖溶液。又如盛于试管内的培养基以0.1Mpa,121.5℃灭菌20min即可,而盛于大瓶内的培养基最好以0.1Mpa,122℃灭菌30min。

    (三)器材

牛肉膏蛋白胨培养基,培养皿(6套一包),手提式高压蒸气灭菌锅等。

(四)操作步骤

1.首先将内层锅取出,再向外层锅内加入适量的水,使水面与三角搁架相平为宜。 

切勿忘记加水,同时水量不可过少,以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故。

2.放回内层锅,并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤,以免防碍蒸气流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与锅壁接触,以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。

3.加盖,并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓,使螺栓松紧一致,勿使漏气。

4.用电炉或煤气加热,并同时打开排气阀,使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后,关上排气阀,让锅内的温度随蒸气压力增加到逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时,控制热源,维持压力至所需时间。本实验用0.1Mpa,121.5℃,20min灭菌。

灭菌的主要因素是温度而不是压力。因此锅内冷空气必须完全排尽后,才能关上排气阀,维持所需压力。

5.灭菌所需时间到后,切断电源或关闭煤气,让灭菌锅内温度自然下降,当压力表的压力降至“0”时,打开排气阀,旋松螺栓,打开盖子,取出灭菌物品。

压力一定要降到“0”时,才能打开排气阀,开盖取物。否则就会因锅内压力突然下降,使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口,造成棉塞沾染培养基而发生污染,甚至灼伤操作者。

6.将取出的灭菌培养基,需摆斜面的则摆成斜面,然后放入37℃温箱培养24h,经检查若无杂菌生长,即可待用。


三、紫外线灭菌


(一)目的要求

了解紫外线灭菌的原理和方法

(二)基本原理

紫外线灭菌是用紫外线灯进行的。波长为200~300nm的紫外线都有杀菌能力,其中以260nm的杀菌力最强。在波长一定的条件下,紫外线的杀菌效率与强度和时间的乘积成正比。紫外线杀菌机理主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成和DNA链的交联,从而抑制了DNA的复制。另一方面,由于辐射能使空气中的氧电离成[O],再使O2氧化生成臭氧(O3)或使水(H2O)氧化生成过氧化氢(H2O2)。O3和H2O2均有杀菌作用。紫外线穿透力不大,所以,只适用于无菌室,接种箱,手术室内的空气及物体表面的灭菌。紫外线灯距照射物以不超过1.2m为宜。

此外,为了加强紫外线灭菌效果,在打开紫外灯以前;可在无菌室内(或接种箱内)喷洒3%~5%石炭酸溶液,一方面使空气中附着有微生物的尘埃降落,另一方面也可以杀死一部分细菌。无菌室内的桌面、凳子可用2%~3%的来苏尔擦洗,然后再开紫外灯照射,即可增强杀菌效果,达到灭菌目的。

(三)器材

1.培养基 牛肉膏蛋白胨平板。

2.溶液或试剂 3%~5%石炭酸或2%~3%来苏尔溶液。

3.仪器或其他用具 紫外线灯。

(四)操作步骤

l.单用紫外线照射

(1)在无菌室内或在接种箱内打开紫外线灯开关,照射30min,将开关关闭。

(2)将牛肉膏蛋白胨平板盖打开15min,然后盖上皿盖。置37℃培养24h。共做三套。

   (3)检查每个平板上生长的菌落数。如果不超过4个,说明灭菌效果良好,否则,需延长照射时间或同时加强其他措施。

    2.化学消毒剂与紫外线照射结合使用

(1)在无菌室内,先喷洒3%~5%的石炭酸溶液,再用紫外线灯照射15imn。

(2)无菌室内的桌面,凳子用2%~3%来苏尔擦洗,再打开紫外线灯照射15min。

    (3)检查灭菌效果[方法同“单用紫外线照射”(3)]。

    因紫外线对眼结膜及视神经有损伤作用,对皮肤有刺激作用,故不能直视紫外线灯光下工作。


四  微孔滤膜过滤除菌


(一)目的要求

1.了解过滤除菌的原理。

2.掌握微孔滤膜过滤除菌的方法。

(二)基本原理

过滤除菌是通过机械作用滤去液体或气体中细菌的方法。根据不同的需要选用不同的滤器和滤板材料。微孔滤膜过滤器是由上下二个分别具有出口和入口连接装置的塑料盖盒组成,出口处可连接针头,人口处可连接针筒,使用时将滤膜装入两塑料盖盒之间,旋紧盖盒,当溶液从针筒注入滤器时,此滤器将各种微生物阻留在微孔滤膜上面,从而达到除菌的目的。根据待除菌溶液量的多少,可选用不同大小的滤器。此法除菌的最大优点是可以不破坏溶液中各种物质的化学成分,但由于滤量有限,所以一般只适用于实验室中小量溶液的过滤除菌。

(三)器材

1.培养基  2%的葡萄糖溶液,肉汤蛋白胨平板。

2.仪器或其他用具  注射器,微孔滤膜过滤器,0.22μm滤膜,无菌试管,镊子,玻璃刮棒。

(四)操作步骤

l.组装、灭菌

将0.22μm孔径的滤膜装入清洗干净的塑料滤器中,旋紧压平,包装灭菌后待用(0.lMPa,121.5℃灭菌20min)。

2.连接

将灭菌滤器的入口在无菌条件下,以无菌操作方式连接于装有待滤溶液(2%葡萄糖溶液)的注射器上,将针头与出口处连接并插入带橡皮塞的无菌试管中。见图2—3。

3.压滤

将注射器中的待滤溶液加压缓缓挤入过滤到无菌试管中,滤毕,将针头拨出。 

压滤时,用力要适当,不可太猛太快,以免细菌被挤压通过淀胶.

4.无菌检查

无菌操作吸取除菌滤液0.1ml于肉汤蛋白胨平板上,涂布均匀,置37℃温室中培养24h,检查是否有菌生长。

5.清洗

弃去塑料滤器上的微孔滤膜,将塑料滤器清洗干净,并换上一张新的微孔滤膜,组装包扎,再经无菌后使用。

整个过程应在无菌条件下严格无菌操作,以防污染,过滤时应避免各连接处出现渗漏现象。


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