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培养基的配制

一、实验目的和内容


目的:学习和掌握配制培养基的一般方法和步骤。

内容:1.牛肉膏蛋白陈培养基的配制。

2.高氏1号培养基的配制。

3.马丁氏培养基的配制。


二、实验材料和用具


  牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉红、链霉素、1mol/L NaOH、lmol/L HCl、KNO3、NaCl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O。

试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、线绳、纱布、漏斗、漏斗架、胶管、止水夹等。


三、操作步骤


(一)牛肉膏蛋白胨培养基的配制

牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。其配方如下:

牛肉膏3g,蛋白胨10g,Nacl5g,琼脂15~20g,水1000mL,PH7.4~7.6

    1.称药品  按实际用量计算后,按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量,用热水溶解后倒入大烧杯;也可放在称量纸上称量,随后放入热水中,牛肉膏使与称量纸分离,立即取出纸片。蛋白胨极易吸潮,故称量时要迅速。

2.加热溶解  在烧杯中加入少于所需要的水量,然后放在石棉网上,小火加热,并用玻棒搅拌,待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基,则将称好的琼脂放入己溶解的药品中,再加热融化,此过程中,需不断搅拌,以防琼脂糊底或溢出,最后补足所失的水分。

3. 调pH   检测培养基的pH,若pH偏酸,可滴加lmol/L NaOH,边加边搅拌,并随时用pH试纸检测,直至达到所需pH范围。若偏碱,则用lmol/L HCl进行调节。pH的调节通常放在加琼脂之前。应注意pH值不要调过头,以免回调而影响培养基内各离子的浓度。

4.过滤   液体培养基可用滤纸过滤,固体培养基可用4层纱布趁热过滤,以利培养的观察。但是供一般使用的培养基,这步可省略。

5.分装   按实验要求,可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。

分装量:固体培养基约为试管高度的l/5,灭菌后制成斜面。分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜。半固体培养基以试管高度的1/3为宜,灭菌后垂直待凝。

6.加棉塞   试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉)制作的棉塞。棉塞的形状、大小和松紧度要合适,四周紧贴管壁,不留缝隙,才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。要使棉塞总长约3/5塞入试管口或瓶口内,以防棉塞脱落。有些微生物需要更好的通气,则可用8层纱布制成通气塞。有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞。

7.包扎   加塞后,将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸,以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。若培养基分装于试管中,则应以5支或7支在一起,再于棉塞外包一层牛皮纸,用绳扎好。然后用记号笔注明、培养基名称、组别、日期。

8.灭菌   将上述培养基于121.3℃湿热灭菌20min。如因特殊情况不能及时灭菌,则应故人冰箱内暂存。

9.摆斜面  灭菌后,如制斜面,则需趁热将试管口端搁在一根长木条上,并调整斜度,便斜面的长度不超过试管总长的1/2。

10.无菌检查 将灭菌的培养基放入37℃温箱中培养24~48h,无菌生长即可使用,或贮存于冰箱或清洁的橱内,备用。


(二)高氏l号培养基的配制

高氏1号培养基是用于分离和培养放线菌的合成培养基。其配方如下:

可溶性淀粉20g,KNO3 1g,NaCl 0.5g,K2HPO4·3H2O 0.5g,MgSO4·7H2O 0.5g,FeSO4·7H2O 0.01g,琼脂15~20g,水1000mL,pH7.4~7.6。

l.称量和溶解   先计算后称量,按用量先称取可溶性淀粉,放入小烧杯中,并用少量冷水将其调成糊状,再加至少于所需水量的水,继续加热,边加热边搅拌,至其完全溶解。再加入其他成分依次溶解。对微量成分FeSO4·7H2O可先配成高浓度的贮备液后再加入,方法是先在1000mL中加入1g的FeSO4·7H2O,配成浓度为0.01g/mL的贮备液,再在1000mL培养基中加入以上贮备液1mL即可。待所有药品完全溶解后,补充水分到所需的总体积。如要配制固体培养基,其琼脂溶解过程同牛肉膏蛋白胨培养基配制。

2.pH调节、分装、包扎及无菌检查  同牛肉膏蛋白胨培养基配制。


(三)马丁氏培养基的配制

马丁氏培养基是用于分离真菌的选择培养基。其配方如下:

K2HPO4 1g,MgSO4·7H2O 0.5g,蛋白胨5g,葡萄糖l0g,琼脂15~20g,水1000mL,自然pH。

1.称量和溶解  先计算后称量,按用量称取各成分,并将其溶解在少于所需的水中。待各成分完全溶解后,补充水分到所需体积。再将孟加拉红配成1%的水溶液,在1000mL培养液中加入以上孟加拉红溶液3.3mL,混匀后,加入琼脂加热融化,方法同牛肉膏蛋白胨培养基配制。

2.分装、包扎、灭菌及无菌检查同牛肉膏蛋白膝培养基配制。

  3.链霉素的加入  链霉素受热容易分解,所以临用时,将培养基融化后待温度降至45℃左右时才能加入。可先将链霉素配成1%的溶液(配好的链霉素溶液保存于-20℃),在100mL培养基中加1%链霉素0.3mL ,使每毫升培养基中合链霉素30μg。


四、注意事项


  1. 称药品用的牛角匙不要混用,称完药品应及时盖紧瓶盖。调pH时要小心操作,避免回调。不同培养基各有配制特点,要注意具体操作。


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