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mRNA的分离与纯化

一、实验原理


真核细胞的mRNA分子最显著的结构特征是具有5’端帽子结构(m7G)和3’端的Poly(A)尾巴。绝大多数哺乳类动物细胞mRNA的3’端存在20-30个腺苷酸组成的Poly(A)尾,通常用Poly(A+)表示。这种结构为真核mRNA的提取,提供了极为方便的选择性标志,寡聚(dT)纤维素或寡聚(U)琼脂糖亲合层析分离纯化mRNA的理论基础就在于此。


mRNA的分离方法较多,其中以寡聚(dT)-纤维素柱层析法最为有效,已成为常规方法。此法利用mRNA 3’末端含有Poly(A+)的特点,在RNA流经寡聚(dT)纤维素柱时,在高盐缓冲液的作用下,mRNA被特异地结合在柱上,当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下,mRNA被洗脱,经过两次寡聚(dT)纤维柱后,即可得到较高纯度的mRNA。
寡聚(dT)纤维素柱纯化mRNA


二、试剂准备


1.3M醋酸钠(pH 5.2)
2.0.1M NaOH
3.1×上样缓冲液:20mM Tris-HCl(pH 7.6);0.5M NaCl;1M EDTA(pH 8.0);0.1%SLS(十二烷基氨酸钠。配制时可先配制Tris-HCl(pH =7.6)、NaCl、EDTA(pH 8.0)的母液,经高压消毒后按各成分确切含量,经混合后再高压消毒,冷却至65℃时,加入经65℃温育(30min)的10%SLS至终浓度为0.1%。
4.洗脱缓冲液:10mM Tris-HCl(pH 7.6);1mM EDTA(pH 8.0);0.05% SDS
5.无水乙醇、70%乙醇
6.DEPC


三、操作步骤


1.将0.5-1.0g寡聚(dT)-纤维悬浮于0.1M的NaOH溶液中。
2.用DEPC处理的1ml注射器或适当的吸管,将寡聚(dT)-纤维素装柱0.5-1ml,用3倍柱床体积的DEPC H2O洗柱。
3.使用1×上样缓冲液洗柱,直至洗出液pH值小于8.0。
4.将RNA溶解于DEPC H2O中,在65℃中温育10min左右,冷却至室温后加入等体2×上样缓冲液,混匀后上柱,立即收集流出液。当RNA上样液全部进入柱床后,再用1×上样缓冲液洗柱,继续收集流出液。
5.将所有流出液于65℃加热5min,冷却至室温后再次上柱,收集流出液。
6.用5-10倍柱床体积的1×上样缓冲液洗柱,每管1ml分部收集,OD260测定RNA含量。前部分收集管中流出液的OD260值很高,其内含物为无Poly(A)尾的RNA。后部分收集管中流出液的OD260值很低或无吸收。
7.用2-3倍柱容积的洗脱缓冲液洗脱Poly(A+)RNA,分部收集,每部分为1/3-1/2柱体积。
8.OD260测定Poly(A+)RNA分布,合并含Poly(A+)RNA的收集管,加入1/10体积3M NaAc(pH5.2)、2.5倍体积的预冷无水乙醇,混匀,-20℃放置30min。
9.4℃离心,10000g×15min,小心吸弃上清。用70%乙醇洗涤沉淀。[注意:此时Poly(A+)RNA的沉淀往往看不到]。4℃离心,10000g×5min,弃上清,室温晾干。
10. 用适量的DEPC H2O溶解RNA。


四、注意事项


1.整个实验过程必须防止Rnase的污染。
2.步骤(4)中将RNA溶液置65℃中温育然后冷却至室温再上样的目的有两个,一个是破坏RNA的二级结构,尤其是mRNA Poly(A+)尾处的二级结构,使Poly(A+)尾充分暴露,从而提高Poly(A+)RNA的回收率;另一个目的是能解离mRNA与rRNA的结合,否则会导致rRNA的污染。所以此步骤不能省略。
3.十二烷基肌氨酸钠盐在18℃以下溶解度下降,会阻碍柱内液体流动,若室温低于18℃最好用LiCl替代NaCl。
4.寡聚(dT)-纤维素柱可在4℃贮存,反复使用。每次使用前应该依次用NaOH、灭菌 ddH2O、上样缓冲液洗柱。
5.一般而言,107哺乳动物培养细胞能提取1-5μg Poly(A+)RNA,约相当于上柱总RNA量的1%-2%。


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