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Northern Blot

一、实验原理


与Southern杂交相似,Northern杂交也采用琼脂糖凝胶电泳,将分子量大小不同的RNA分离开来,随后将其原位转移至固相支持物(如尼龙膜、硝酸纤维膜等)上,再用放射性(或非放射性)标记的DNA或RNA探针,依据其同源性进行杂交,最后进行放射自显影(或化学显影),以目标RNA所在位置表示其分子量的大小,而其显影强度则可提示目标RNA在所测样品中的相对含量(即目标RNA的丰度)。但与Soughern杂交不同的是,总RNA不需要进行酶切,即是以各个RNA分子的形式存在,可直接应用于电泳;此外,由于碱性溶液可使RNA水解,因此不进行碱变性,而是采用甲醛等进行变性电泳。虽然Northern也可检测目标mRNA分子的大小,但更多的是用于检测目的基因在组织细胞中有无表达及表达的水平如何。


二、 试剂准备


1.   0.5M EDTA: EDTA 16.61g加ddH2O至80ml, 调pH至8.0, 定容至100ml。
2. 50mM NaAc: NaAc 3.4g 加ddH2O至500ml, 加DEPC 0.5ml, 振荡, 37℃过夜,高压灭菌。
3. 5×甲醛凝胶电泳缓冲液: MOPS [3-(N-玛琳代)丙磺酸] 10.3g加50mM NaAc 400ml, 用2N NaOH调pH至7.0, 再加入0.5M EDTA 10ml, 加DEPC H2O至500ml。无菌抽滤,室温避光保存。
4. 20×SSC: NaCl 175.3g、柠檬酸三钠88.2g,加ddH2O至800ml,用2N NaOH调pH至7.0,再用ddH2O定容至1000ml。DEPC处理、高压灭菌。
5. 6×SSC: 20×SSC 300ml加ddH2O至1000ml。DEPC处理,高压灭菌。
6.50×Denhardt : 聚蔗糖0.5g、聚乙烯吡咯烷酮0.5g、牛血清白蛋白(BSA)0.5g加dd H2O至50ml,无菌抽滤、分装。
7.1M Na2HPO4: Na2HPO4?12H2O 35.81g, 加dd H2O至100ml。
8. 1M NaH2PO4: NaH2PO4?2H2O 15.6g, 加dd H2O至100ml。
9. 0.1M 磷酸钠缓冲液(pH 6.6): Na2HPO4 35.2ml加NaH2PO4 64.8ml 。
10.STE缓冲液: 1M Tris-HCl(pH 8.0) 2.5ml,0.5M EDTA, 0.5ml,5M NaCl 5ml,加dd H2O至250ml。
11.预杂交液: 20×SSC 5ml,甲酰胺10ml,50×Denhardt 4ml,1M磷酸钠缓冲液0.2ml(pH6.6),10%SDS 1ml, 总体积 20ml。临用前加入变性鲑鱼精DNA(10mg/ml),使终浓度为4μl/ml。
12. DEPC H2O: 1000mldd H2O中加入DEPC 1ml,充分振荡,37℃过夜,高压灭菌。


三、操作步骤


1. 总RNA提取:见相关内容。
2. 变性胶的制备:取琼脂糖0.2g,加入DEPC H2O 12.4ml,加热熔化,于保温状态下加入5×甲醛凝胶电泳缓冲液4.0ml、37%甲醛3.6ml,混匀、制胶。待胶凝固后,置1×甲醛凝胶电泳缓冲液中预电泳5min。
3. 样品制备:取总RNA4.5μl(约20-30μg) ,加入5×甲醛凝胶电泳缓冲液 4.0μl、37%甲醛3.6μl、甲酰胺10μl,65℃温育15min、冰浴5min。加入EB(1μg/μl)1μl、上样缓冲液2μl。
4. 电泳:上样,50V电泳(电泳时间约2hr左右)。电泳结束后将胶块置紫外灯下,观察RNA的完整性,记录18S、28S条带的位置(离加样孔的距离)。


5.   将RNA从变性胶转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜:
(1) 按胶块大小剪取膜一张,用DEPC水中浸湿后,置于20×SSC中浸泡1hr。剪去膜一角。
(2)将胶块切去一角,并在20×SSC浸泡15min×2次。
(3)用长和宽均大于凝胶的一块有机玻璃板作为平台,将其放入大的干烤皿上,上面放一张Whatman 3MM滤纸,倒入20×SSC使液面略低于平台表面,当平台上方的3MM滤纸湿透后,用玻棒赶出所有气泡。
(4)将凝胶翻转后置于平台上湿润的3MM滤纸中央,3MM滤纸和凝胶之间不能滞留气泡。
(5)用Parafilm膜围绕凝胶四周,以此作为屏障,阻止液体自液池直接流至胶上方的纸巾。
(6) 在凝胶上方放置预先已浸湿的尼龙膜,排除膜与凝胶之间的气泡。
(7) 将二张已湿润的、与凝胶大小相同的3MM滤纸置于膜的上方,排除滤纸与滤膜之间的气泡。
(8) 将一叠(5-8cm厚)略小于3MM滤纸的纸巾置于3MM滤纸的上方,并在纸巾上方放一块玻璃,然后用一个重约500克的重物压在玻璃板上。其目的是建立液体自液池经凝胶向膜上行流路,以洗脱凝胶中的RNA并使其聚集在膜上。


6.使上述RNA转移持续进行15hr左右。在转膜过程中,当纸巾浸湿后,应更换新的纸巾。
7.转移结束后,揭去凝胶上方的纸巾和3MM滤纸。将膜在6×SSC中浸泡5 min,以去除膜上残留的凝胶。
8.将凝胶置紫外灯下,观察胶块上有无残留的RNA。
9.膜置80℃,真空干烤1-2hr。烤干后的膜用塑料袋密封,4℃保存备用。


10. 探针标记(Prime-a-Gene Labeling System, Promega公司):
(1) 取模板DNA 25ng于0.5ml离心管中,95-100℃变性5min,冰浴5min。
(2) dNTPmix的制备: 取dGTP 1μl、dATP 1μl、dTTP 1μl混匀。
(3)将下列反应成份混合,加入上述微量离心管中:
  dNTPmix     2.0μl
  BSA(10mg/ml )   2.0μl
  5×buffer   10.0μl
  Klenow 酶(5u/μl) 1.0μl
  α-32P-dCTP   5.0μl
加入适量dd H2O使反应总体积达50μl,轻轻混匀。室温下反应1hr。


11.预杂交:将膜的反面紧贴杂交瓶,加入预杂交液5ml,42℃预杂交3hr。
12.杂交:将变性的探针(95-100℃变性5min,冰浴5min)加入到预杂交液中,42℃杂交16hr。
13.洗膜:
(1)倾去杂交液。
(2)2×SSC/0.1%SDS室温洗15min。
(3)0.2×SSC/0.1%SDS,55℃洗15min×2次。
14.压片:将膜用dd H2O漂洗片刻,用滤纸吸去膜上水份。用薄型塑料纸将膜包好,置于暗盒中,在暗室中压上X光片。暗盒置-70℃放射自显影3~7天左右。


四、注意事项


1.操作时必须仔细、小心,严格按同位素操作规程进行,以防止同位素污染。
2.必要时,可采用Sephades G-50柱层析法纯化标记的探针(见本节附录),以去除标记反应中未结合的(游离的)核苷酸。
3.膜的重复使用:结合了待测RNA的膜与探针杂交后,可经碱或热变性方法将探针洗脱,膜可反复使用与其它探针杂交。方法如下:杂交的膜(注意:杂交过的膜在保存过程中不能干燥,否则探针将会与膜形成不可逆的结合)置 100℃ 0.5% SDS中煮沸3min,自然冷却至室温后,将膜放入双蒸水中漂洗2-3遍。取出膜,用滤纸吸去膜表面的水份。将膜直接进行另一种探针的杂交或用保鲜膜包好,室温下真空保存。


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