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表达蛋白的分离与纯化

一、实验原理


大肠杆菌表达蛋白以可溶和不溶两种形式存在,需要不同的纯化策略。现在,许多蛋白质正在被发现而事先并不知道它们的功能,这些自然需要将蛋白质分离出来后,进行进一步的研究来获得。分析蛋白质的方法学现已极大的简化和改进。必须承认,蛋白质纯化比起DNA克隆和操作来是更具有艺术性的,尽管DNA序列具有异乎寻常的多样性(因而它是唯一适合遗传物质的),但它却有标准的物理化学性质,而每一种蛋白质则有它自己的由氨基酸序列决定的物理化学性质(因而它具有执行众多生物学功能的用途)。


正是蛋白质间的这些物理性质上的差异使它们得以能进行纯化但这也意味着需要对每一种待纯化的蛋白质研发一套新的方法。所幸的是,尽管存在这种固有的困难,但现已有多种方法可以利用,蛋白质纯化策略也已实际可行。目前,待研究蛋白或酶的基因的获得已是相当普遍的事。可诱导表达系统特别是Studier等发展的以噬菌体T7RNA聚合酶为基础的表达系统的出现使人们能近乎常规地获得过表达(overexpression),表达水平可达细胞蛋白的2%以上,有些甚至高达50%。


可溶性产物的纯化(融合T7 Tag的表达蛋白)


二、试剂准备
采用T7 Tag Affinity Purification Kit
1.T7 Tag抗体琼脂。
2.B/W缓冲液:4.29mM Na2HPO4,1.47 mM KH2PO4,2.7 mM KCl,3. 0.137mM NaCl,1%吐温-20,pH7.3。
4. 洗脱缓冲液: 0.1M柠檬酸,pH2.2。
5. 中和缓冲液:2M Tris,pH10.4。
6. PEG 20000。


三、操作步骤
1.100ml 含重组表达质粒的菌体诱导后,离心5000g×5min,弃上清,收获菌体,用10ml预冷的B/W缓冲液重悬。
2. 重悬液于冰上超声处理,直至样品不再粘稠,4℃离心 14000g×30min,取上清液,0.45μm膜抽滤后作为样品液。
3. 将结合T7?Tag抗体的琼脂充分悬起,平衡至室温,装入层析柱中。
4. B/W缓冲液平衡后样品液过柱。
5. 10ml B/W缓冲液过柱,洗去未结合蛋白。
6. 用5ml洗脱缓冲液过柱,每次1ml,洗脱液用含150μl中和缓冲液的离心管收集,混匀后置于冰上,直接SDS-PAGE分析。
7. 将洗脱下来的蛋白放入透析袋中,双蒸水透析24hr,中间换液数次。
8. 用PEG 20000浓缩蛋白。


四、注意事项


蛋白在过层析柱前,要0.45μm膜抽滤,否则几次纯化后,柱子中会有不溶物。


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