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包涵体的纯化

一、实验原理


包涵体是外源基因在原核细胞中表达时,尤其在大肠杆菌中高效表达时,形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒,在显微镜下观察时为高折射区,与胞质中其他成分有明显区别。包涵体形成是比较复杂的,与胞质内蛋白质生成速率有关,新生成的多肽浓度较高,无充足的时间进行折叠,从而形成非结晶、无定形的蛋白质的聚集体;此外,包涵体的形成还被认为与宿主菌的培养条件,如培养基成分、温度、pH值、离子强度等因素有关。


细胞中的生物学活性蛋白质常以可融性或分子复合物的形式存在,功能性的蛋白质总是折叠成特定的三维结构型。包涵体内的蛋白是非折叠状态的聚集体,不具有生物学活性,因此要获得具有生物学活性的蛋白质必须将包涵体溶解,释放出其中的蛋白质,并进行蛋白质的复性。包涵体的主要成分就是表达产物,其可占据集体蛋白的40%~95%,此外,还含有宿主菌的外膜蛋白、RNA聚合酶、RNA、DNA、脂类及糖类物质,所以分离包涵体后,还要采用适当的方法(如色谱法)进行重组蛋白质的纯化。


二、试剂配制


1.缓冲液A:50mM Tris-HCl(pH8.0),2mM EDTA,100mM NaCl。
2.缓冲液B:50mM Tris-HCl(pH8.0),1mM EDTA,100 mM NaCl,1%NP-40。
3.缓冲液Ⅰ:50mM Tris-HCl (pH8.0),2mM EDTA,100 mM NaCl,0.5%Triton X-100(V/V),4M脲素。
4.缓冲液Ⅱ:50M Tris-HCl(pH8.0),2mM EDTA,100 mM NaCl,3% Triton X-100 。
5.缓冲液Ⅲ:50mM Tris-HCl(pH8.0),2mM EDTA,100 mM NaCl,0.5%Triton X-100,2M 盐酸胍。
6.缓冲液C:8M脲素,10mMβ-巯基乙醇,100 mM Tris-HCl(pH8.0),2mM EDTA及脱氧胆酸钠。


三、操作步骤


1.用缓冲液A漂洗菌体细胞(10ml/g), 离心6000g×15min,收集菌体细胞,重复此步骤,将菌体细胞再在缓冲液A中洗涤一次。
2.将漂洗过的菌体细胞悬浮于缓冲液B中,超声破碎,镜检,破碎率高于95%,离心1500g×30min,收集包涵体沉淀。
3.将包涵体沉淀用缓冲液Ⅰ、缓冲液Ⅱ、缓冲液Ⅲ分别超声洗涤一次,1500g 离心收集包涵体沉淀。
4.包涵体的溶解:用含高浓度脲素的缓冲液室温放置30min,然后离心1500g×30min,留上清。将溶解后的蛋白质适当稀释,磁力搅拌,透析过夜。
5.溶解后的包涵体蛋白可通过亲和层析进一步纯化。


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