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Southern 杂交

一、实验原理


Southern 杂交是分子生物学的经典实验方法。其基本原理是将待检测的DNA样品固定在固相载体上,与标记的核酸探针进行杂交,在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交信号。通过Southern杂交可以判断被检测的DNA样品中是否有与探针同源的片段以及该片段的长度。该项技术广泛被应用在遗传病检测、DNA指纹分析和PCR产物判断等研究中。但由于该技术的操作比较烦琐、费时,所以现在有一些其他的方法可以代替Southern 杂交。但该技术也有它的独特之处,是目前其他方法所不能替代的,如限制性酶切片段的多态性(RFLP)的检测等。


二、基因组DNA的制备(前述)


三、基因组DNA的限制酶切


根据实验目的决定酶切DNA的量。一般Southern杂交每一个电泳通道需要10-30μg的DNA。购买的限制性内切酶都附有相对应的10倍浓度缓冲液,并可从该公司的产品目录上查到最佳消化温度。为保证消化完全,一般用2-4U的酶消化1μg 的DNA。消化的DNA浓度不宜太高,以0.5μg /μl 为好。由于内切酶是保存在50%甘油内的,而酶只有在甘油浓度<5%的条件下才能发挥正常作用,所以加入反应体系的酶体积不能超过1/10。
具体操作如下:在1.5ml离心管中依次加入


  DNA(1μg /μl)       20   μg
  10×酶切buffer       4.0 μl
  限制性内切酶(10U/μl)   5.0 μl
  加ddH2O         至 500 μl


在最适温度下消化1-3hr。消化结束时可取5μl电泳检测消化效果。如果消化效果不好,可以延长消化时间,但超过6hr已没有必要。或者放大反应体积,或者补充酶再消化。如仍不能奏效,可能的原因是DNA样品中有太多的杂质,或酶的活力下降。
消化后的DNA加入1/10 体积的0.5M EDTA,以终止消化。然后用等体积酚抽提、等体积氯仿抽提,2.5倍体积乙醇沉淀,少量TE溶解(参见DNA提取方法,但离心转速要提高到12000g,以防止小片段DNA的丢失)。


如果需要两种酶消化DNA,而两种酶的反应条件可以一致,则两种酶可同时进行消化;如果反应条件不一致,则先用需要低离子强度的酶消化,然后补加盐类等物质调高反应体系的离子强度,再加第二种酶进行消化。


四、基因组DNA消化产物的琼脂糖凝胶电泳


琼脂糖凝胶电泳是目前分离核酸片段最常用的方法,制备简单,分离范围广(200bp-50kb),实验成本低。下表列举了不同浓度琼脂糖凝胶能分离的DNA片段范围。
    表:不同浓度琼脂糖凝胶分离DNA片段的范围
琼脂糖凝胶浓度(%)     分离DNA片段范围(kb)
    0.3             5-60
    0.6             1-20
    0.7           0.8-10
    0.9           0.5-7
    1.2           0.4-6
    1.5                       0.2-3
    2.0           0.1-2
1. 制备0.8%凝胶:一般用于Southern杂交的电泳胶取0.8%。
2. 电泳:电泳样品中加入6×Loading 缓冲液,混匀后上样,留一或两泳道加DNA Marker。1-2V/cm,DNA从负极泳向正极。电泳至溴酚蓝指示剂接近凝胶另一端时,停止电泳。取出凝胶,紫外灯下观察电泳效果。在胶的一边放置一把刻度尺,拍摄照片。正常电泳图谱呈现一连续的涂抹带,照片摄入刻度尺是为了以后判断信号带的位置,以确定被杂交的DNA长度。


五、DNA从琼脂糖凝胶转移到固相支持物


转移就是将琼脂糖凝胶中的DNA 转移到硝酸纤维膜(NC膜)或尼龙膜上,形成固相DNA。转移的目的是使固相DNA与液相的探针进行杂交。常用的转移方法有盐桥法、真空法和电转移法。这里介绍经典的盐桥法(又称为毛细管法)。
(一)试剂准备
1.变性液:0.5M NaOH;1.5 M NaCl。
2.中和液:1M Tris-HCl(pH 7.4);1.5M NaCl;
3.转移液(20×SSC): NaCl 175.3g; 柠檬酸三钠82.2g,NaOH 调pH 至7.0,加ddH2O至1000ml。


(二)操作步骤
1.碱变性:室温下将凝胶浸入数倍体积的变性液中30min。
2.中和:将凝胶转移到中和液15min。
3.转移 按凝胶的大小剪裁NC膜或尼龙膜并剪去一角作为标记,水浸湿后,浸入转移液中5min。剪一张比膜稍宽的长条Whatman 3mm滤纸作为盐桥,再按凝胶的尺寸剪3-5张滤纸和大量的纸巾备用。按下图所示进行转移。( 转移过程一般需要8-24hr,每隔数hr换掉已经湿掉的纸巾。转移液用20×SSC。注意在膜与胶之间不能有气泡。整个操作过程中要防止膜上沾染其他污物。)
4. 转移结束后取出NC膜,浸入6×SSC溶液数min,洗去膜上沾染的凝胶颗粒,置于两张滤纸之间,80°C烘2hr,然后将NC膜夹在两层滤纸间,保存于干燥处。


六、探针标记


进行Southern 杂交的探针一般用放射性物质标记或用地高辛标记。放射性标记灵敏度高,效果好;地高辛标记没有半衰期,安全性好。这里介绍放射性标记。
探针的标记方法有随机引物法、切口平移法和末端标记法,有一些试剂盒可供选择,操作也很简单。
以下为Promega公司随机引物试剂盒提供的标记步骤:
1.取25-50ng模板DNA于0.5ml离心管中,100℃变性5min,立即置冰浴。
2.在另一个0.5ml离心管中加入:
  Labeling 5×buffer       10μl
  (含有随机引物)
  dNTPmix             2μl
  (含 dCTP、dGTP、dTTP 各 0.5mM)
  BSA(小牛血清白蛋白)       2μl
  [a-32P]dATP           3μl
  Klenow酶           5U
3.将变性模板DNA加入到上管中,加ddH2O至50μl,混匀。室温或37℃ 1hr。
4.加50μl 终止缓冲液终止反应。
标记后的探针可以直接使用或过柱纯化后使用。由于a-32P的半衰期只有14天,所以标记好的探针应尽快使用。探针的比活性最好大于109计数/分/μl。


七、杂交


Southern 杂交一般采取的是液-固杂交方式,即探针为液相,被杂交DNA为固相。杂交发生于一定条件的溶液(杂交液)中并需要一定的温度,可以用杂交瓶或杂交袋并使液体不断的在膜上流动。杂交液可以自制或从公司购买,不同的杂交液配方相差较大,杂交温度也不同。下面给出的为一杂交液配方:
PEG 6000 10%;SDS 0.5%;6×SSC;50%甲酰胺。该杂交液的杂交温度为42℃。
1.预杂交
NC膜浸入2×SSC中5min,在杂交瓶中加入杂交液(8cm×8 cm的膜加5ml即可),将膜的背面贴紧杂交瓶壁,正面朝向杂交液。放入42℃杂交炉中,使杂交体系升到42℃。取经超声粉碎的鲑鱼精DNA(已溶解在水或TE中)100℃加热变性5min,迅速加到杂交瓶中,使其浓度达到100μg/ml。继续杂交4hr。鲑鱼精DNA的作用是封闭NC膜上没有DNA转移的位点,降低杂交背景、提高杂交特异性。
2.杂交
倒出预杂交的杂交液,换入等量新的已升温至42℃的杂交液,同样加入变性的鲑鱼精DNA。将探针100℃加热5min,使其变性,迅速加到杂交瓶中。42℃杂交过夜。


八、洗膜与检测


取出NC膜,在2×SSC溶液中漂洗5min,然后按照下列条件洗膜:
2×SSC/0.1% SDS,42℃,10min;
1×SSC/0.1% SDS,42℃,10min;
0.5×SSC/0.1% SDS,42℃,10min;
0.2×SSC/0.1% SDS,56℃,10min;
0.1×SSC/0.1% SDS,56℃,10min。
在洗膜的过程中,不断振摇,不断用放射性检测仪探测膜上的放射强度。实践证明,当放射强度指示数值较环境背景高1-2倍时,是洗膜的终止点。上述洗膜过程无论在哪一步达到终点,都必须停止洗膜。洗完的膜浸入2×SSC中2min,取出膜,用滤纸吸干膜表面的水份,并用保鲜膜包裹,注意保鲜膜与NC膜之间不能有气泡。将膜正面向上,放入暗盒中(加双侧增感屏),在暗室的红光下,贴覆两张X光片,每一片都用透明胶带固定,合上暗盒,置-70℃低温冰箱中曝光。根据信号强弱决定曝光时间,一般在1-3天时间。洗片时,先洗一张X光片,若感光偏弱,则再多加两天曝光时间,再洗第二张片子。
影响Southern杂交实验的因素很多,主要有:DNA纯度、酶切效率、电泳分离效果、转移效率、探针比活性和洗膜终止点等。


九、注意事项


1.要取得好的转移和杂交效果,应根据DNA 分子的大小,适当调整变性时间。对于分子量较大的DNA片段(大于15kb),可在变性前用0.2M HCl预处理10min使其脱嘌呤。
2.转移用的NC膜要预先在双蒸水中浸泡使其湿透,否则会影响转膜效果;不可用手触摸NC膜,否则影响DNA的转移及与膜的结合。
3.转移时,凝胶的四周用Parafilm蜡膜封严,防止在转移过程中产生短路,影响转移效率,同时注意NC膜与凝胶及滤纸间不能留有气泡,以免影响转移。
4.注意同位素的安全使用。


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