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PCR产物的克隆

一、实验原理


PCR产物克隆大致分为两类,即平头连接和粘头连接。


平头连接是将制备好的平头载体和补平或削平的PCR产物直接进行连接。载体可用EcoR V或Sma I切成平头;PCR产物纯化后,可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min(利用该酶所具有的3’→5’外切酶活性和5’→3’的聚合酶活性)。如果要求不高,PCR产物也可不加处理。如果使用Stratagene公司的pfu DNA聚合酶或New England Biolabs公司的Vent DNA聚合酶,这两种酶有5’→3’校对能力,扩增出来的PCR产物已经是平头,可以不作平端处理。平端连接的一个显而易见的缺陷是连接效率低下,即使使用很高单位的连接酶,或在反应体系中加入PEG 8000,也只能很有限地提高效率。


粘头连接也可以大致分为两类,一类粘头连接是用某种方法,在载体和PCR产物上产生长的可互补的粘性末端。最普遍的方法是在引物的5’端加入一段某种限制酶的识别序列。如果两个引物选用不同的限制性内切酶识别序列,就可以做到定向连接。另一类利用部分PCR产物3’端带有一个凸出的dAMP的特性,构建3’端带有凸出的dTMP的载体。一般采用的方法是先把载体用某种限制性内切酶消化成平头,在70℃或72℃下在只加入一种dNTP、即dTTP的反应体系中用Taq DNA聚合酶处理半小时(也有人报道处理1~2小时能提高克隆效率,这样加T反应会更彻底)。也可以用末端转移酶来完成加T反应。载体自连、PCR产物串连可以忽略。如果使用ddTTP,效果会更好。这种方法一般称为加T/A法克隆,比平头连接效率高50~100倍。


二、PCR产物的TA克隆 


1.TA克隆构建原理:TA克隆系统由Invitrogen公司(San Diego,CA)发展而来的商业性试剂盒,它用于PCR产物的克隆和测序。其原理是利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A,而T载体是一种带有3’T突出端的载体,在连接酶作用下,可以快速地、一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体的多克隆位点(MCS)中。
2.操作步骤
⑴ 连接反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。
⑵ 10μl体积反应体系如下:
①取T载体1μl (50ng),加入等摩尔数PCR产物 。
②加入含ATP的10×Buffer 1μl,T4 DNA连接酶合适单位,用ddH2O 补足至10μl 。
⑶ 稍加离心,通常为14-16℃水浴连接8-14hr,或4℃过夜。
⑷ 转染,蓝白斑筛选同前。


三、注意事项


1.要获得目的基因的TA克隆,PCR产物的特异性要好。
2.PCR产物在TA克隆前要通过纯化。
3.在PCR产物回收、纯化过程中防止外来DNA污染。



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