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DNA片段回收与纯化

一、实验原理


质粒、噬菌体等经酶切,电泳;PCR产物经电泳后,常常需要对一些DNA电泳片段进行回收和纯化,用于亚克隆、探针标记等。DNA回收和纯化常用方法有压碎法、低融点琼脂糖法、冻融法等,也有现成的试剂盒供应。


(一)、冻融法


1. 紫外灯下仔细切下含待回收DNA的胶条,将切下的胶条(小于0.6g)捣碎,置于1.5ml离心管中;
2. 加入等体积的Tris-HCl饱和酚(pH 7.6),振荡混匀;
3. -20℃放置5-10min;
4. 4℃离心10000g×5min,上层液转移置另一离心管中;
5. 加入1/4体积H2O于含胶的离心管中,振荡混匀;
6. -20℃,放置5-10min;
7. 4℃离心10000g×5min,合并上清液;
8. 用等体积酚/氯仿、氯仿分别抽提一次,取上清;
9. 加入1/10体积3M NaAc(pH 5.2)、2.5倍体积预冷的无水乙醇,混匀;
10. -20℃,静置30min;
11. 4℃离心13000g×10min,弃上清,75%乙醇洗沉淀1-2次,晾干;
12. 加适量H2O或TE溶解沉淀。


(二)、DNA回收试剂盒(QIAquick Gel Extraction Kit Protocol)


1.   紫外灯下仔细切下含待回收DNA的凝胶,置1.5ml离心管中,称重。
2.   加入Buffer QG(每100mg凝胶加Buffer QG 300μl),置50℃水浴10min。
3.   若回收片段小于500bp或大于4kb,则需加入异丙醇(每100mg凝胶加异丙醇100μl),混匀。
4.   将小柱放在2ml收集管上,将上述溶液加于柱上。
5.   4℃离心13000g×1min,弃去收集管中液体。
6.   加入500μl Buffer QG于柱上,4℃离心13000g×1min,弃去收集管中液体。
7.   加入750μl Buffer PE于柱上,4℃离心13000g×1min,弃去收集管中液体。
8.   4℃离心13000g×1min。弃去收集管。
9.   将柱放于一新1.5ml离心管上,加50μl EB于柱上。放置1min,4℃离心13000g×1min。
10. 取5μl 回收DNA电泳检测。


二、 注意事项


紫外灯下切下含待回收DNA的凝胶时,要衬以干净的塑料薄膜,使用无DNA污染的新刀片,其目的在于防止外源DNA的污染。


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