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DNA分子的限制性内切酶消化

一、实验原理


限制性内切酶可特异地结合于一段被称为限制酶识别序列的DNA序列位点上并在此切割双链DNA。绝大多数限制性内切酶识别长度为4、5或6个核苷酸且呈二重对称的特异序列,切割位点相对于二重对称轴的位置因酶而异。一些酶恰在对称轴处同时切割DNA双链而产生带平端的DNA片段,另一些酶则在对称轴两侧相对的位置上分别切断两条链,产生带有单链突出端(即粘端)的DNA片段。


1个单位限制性内切酶是指在最适条件下,在50μl体积1小时内完全切开1μgλ噬菌体DNA所需的酶量。不同的限制性内切酶生产厂家往往推荐使用截然不同的反应条件,甚至对同一种酶也如此。但是,几乎所有的生产厂家都对其生产的酶制剂优化过反应条件,因此购买的内切酶说明书上均有其识别序列和切割位点,同时提供有酶切缓冲液(buffer,10×、5×)和最适条件,使得酶切反应变得日益简单。


二、限制性内切酶对DNA消化的一般方案


1.限制性内切酶反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。
2.20μl体积反应体系如下:
  DNA           0.2-1 μg
  10×酶切buffer       2.0 μl
  限制性内切酶       1-2 u(单位)
  加ddH2O         至 20 μl
限制性内切酶最后加入,轻轻混匀,稍加离心,放置于最适温度水浴并按所需的时间温育,一般为37℃水浴消化1hr。
3.用于回收酶切片段时,反应总体积可达50-200μl,各反应组分需相应增加。
4.多种酶消化时若缓冲液条件相同,可同时加入;否则,先做低温或低盐的酶消化,再做高温或高盐的酶消化。
5.酶切结束时,加入0.5M EDTA(pH 8.0)使终浓度达10mM,以终止反应。或将反应管在65℃水浴放置10min以灭活限制性内切酶活性。
6.如消化反应体积过大,电泳时加样孔盛不下,可加以浓缩:终止反应后,加入0.6体积的5M乙酸铵(或1/10体积3M NaAc)和2倍体积无水乙醇,在冰上放置5min,然后于4℃离心12000g× 5min。倾去含大部分蛋白质的上清液。于室温晾干DNA沉淀后溶于适量TE中(pH 7.6)。
7.如要纯化消化后的DNA,可用等体积酚/氯仿(1∶1)和氯仿各抽提一次,再用乙醇沉淀。


三、电泳检测


取质粒酶切产物适量,加适当loading buffer混匀上样,以未经酶切的质粒或/和酶切的空载体(如有)作对照,采用 1-5V/cm的电压,使DNA分子从负极向正极移动,至合适位置取出置紫外灯下检测,摄片。 


四、注意事项


1. 浓缩的限制性内切酶可在使用前以1×限制酶缓冲液稀释,切勿用水稀释以免酶变性。
2. 购买的限制性内切酶多保存于50%甘油中,于-20℃是稳定的。进行酶切消化时,将除酶以外的所有反应成分加入后即混匀,再从-20℃冰箱中取出酶,立即放置于冰上。每次取酶时都应更换一个无菌吸头,以免酶被污染。加酶的操作尽可能快,用完后立即将酶放回-20℃冰箱。
3.尽量减少反应体积,但要确保酶体积不超过反应总体积的10%,否则酶活性将受到甘油的抑制。
4.通常延长时间可使所需的酶量减少,在切割大量DNA时可用。在消化过程中可取少量反应液进行微量凝胶电泳以检测消化进程。
5.注意星号酶切活力。


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