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λ噬菌体DNA提取

一、实验原理


λ噬菌体是最早使用的克隆载体,λ噬菌体的基因组是一长度约为50kb的双链DNA分子,它在宿主细胞有两种生活途径,其一是裂解生长,环状DNA分子在细胞内多次复制,合成大量噬菌体基因产物,装配成噬菌体颗粒,裂解宿主菌再进行下一次感染;其二是溶源性生长,即感染细胞内λ噬菌体DNA整合到宿主菌染色体DNA中与之一起复制,并遗传给子代细胞,宿主细胞不裂解。


平板培养时,裂解生长形成噬斑。液体培养时,裂解生长使菌液中宿主菌最后全部被裂解而释放出大量的噬菌体颗粒。经过改造的λ噬菌体克隆位点可插入几到几十kb的外源DNA。许多cDNA和基因组文库是以λ噬菌体作为克隆载体构建的。因此,在经文库筛选得到目的克隆后,我们常常需要利用λ噬菌体裂解生长的特点,培养获得大量的噬菌体颗粒,并提取λ噬菌体DNA来开展进一步的工作。


二、试剂准备


1. LB液体培养基:胰化蛋白胨(细菌培养用)10g,酵母提取物(细菌培养用)5g,NaCl 10g,加ddH2O 至1000ml,完全溶解,分装小瓶,15lbf/in2高压灭菌20min。
2. 1.5%琼脂LB固体培养基: 称取1.5g琼脂粉放入300ml锥形瓶,加100mlLB,15 lbf/in2 高压灭菌20min,稍冷却,制备平皿。
3. 20%麦芽糖:麦芽糖20g,加ddH2O 至100ml,0.22μm滤膜过滤。
4. SM液:NaCl 5.8g,MgSO4?7H2O 2g,1M Tris?CL(PH7.5)50ml,2%明胶 5ml,加ddH2O 至1000ml。15lbf/in2高压灭菌20min。
5. RNase A 10mg/ml,TE配制,沸水浴15min,分装后贮存于-20℃。
6.DNase I 10mg/ml,TE配制,分装后贮存于-20℃。
7. PEG 8000
8. 10%SDS
9.EDTA: 0.5M pH8.0
3.苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)
4.异丙醇
5.无水乙醇、70%乙醇


三、操作步骤


1.λ噬菌体平板培养
⑴ 用SM液10倍梯度稀释λ噬菌体原种。
⑵ 取0.1ml各梯度稀释离心到一消毒微量离心管中,加0.2ml新鲜培养的宿主菌,加麦芽糖(0.2%),MgSO4(10mm),37℃温育20min,使噬菌体颗粒吸附于细菌。
⑶ 取熔化(47℃)0.7%琼脂LB固体培养基3ml与上述管混匀,立即倒入预备(2-4天)的含凝固1.5%琼脂LB固体培养基的平板内,轻轻晃动平板使均匀分布。
⑷ 37℃培养6-8hr后,观察噬斑形成。
⑸ 用剪去部分头部的吸头挖取单个噬斑到0.5ml的SM液中,加0.05ml氯仿,震荡。37℃温育10min。
⑹ 重复⑴-⑷,获得单个噬斑滴度。


2. λ噬菌体液体培养
⑴ 取2ml新鲜培养的宿主菌,离心,0.4ml LB培养基重悬,加λ噬菌体0.1ml(新鲜获得的单个噬斑,依滴度使之与宿主菌比约1/500-1000)。
⑵ 加麦芽糖(0.2%),MgSO4(10mM),37℃温育20min,使噬菌体颗粒吸附于细菌。
⑶ 加到100ml LB液体培养基中,加麦芽糖(0.2%),MgSO4(10mM),37℃摇震培养9-12hr后可见裂解发生。
⑷ 加0.1ml氯仿,37℃继续摇震培养10-20min。


3.λ噬菌体DNA提取
(1)将上述裂解液转移至离心管,离心8000g×10min,去细菌碎片,取上清液。
(2)加RNase A、DNaseI 至1μg/ml, 37℃温育30min。
(3)加9.3g PEG 8000,5.8g NaCl,摇匀至溶解,冰浴1hr或4℃过夜。
(4)4℃离心10000g×20min,去上清液。
(5)加2ml SM液,充分洗溶管壁及沉淀,移到新微量离心管,加20μl 10%SDS,20μl 0.5M EDTA,68℃15min。
(6)加等体积苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1),混匀,离心12000g×5min,取上层液到一新微量离心管,加等体积氯仿/异戊醇(24:1),混匀,离心12000g×5min。
(7)取上层液到一新微量离心管,加等体积异丙醇,混匀,-20℃1hr,4℃离心12000g×10min,去上清液。
(8)1ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀1-2次,4℃离心8000g×7min,弃上清,将沉淀室温下晾干。
(9)沉淀溶于20μl TE,-20℃保存备用。


四、注意事项


1.用于裂解的噬菌体、宿主菌为新鲜培养获得时,裂解好、裂解噬菌体收获量大。
2.液体培养裂解时,如到培养时间时裂解尚未发生,可适当提高培养温度或加大摇震速度。
3.RNase A 、DnaseI消化不全,DNA、RNA可粘走部分噬菌体。
4.苯酚/氯仿抽提时,注意PEG、蛋白质等杂质污染,它们会影响限制性内切酶切割。


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