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质粒DNA的碱裂解法提取与纯化

一、实验原理


细菌质粒是一类双链、闭环的DNA,大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份,通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态,但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上,随着染色体的复制而复制,并通过细胞分裂传递到后代。


质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子,重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取,本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。


碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法,其基本原理为:当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时,蛋白质与DNA发生变性,当加入中和液后,质粒DNA分子能够迅速复性,呈溶解状态,离心时留在上清中;蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状,离心时可沉淀下来。


纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如,氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法,但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA,经过苯酚、氯仿抽提,RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA,所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求,故在分子生物学实验室中常用。 


二、试剂准备


1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖,25mM Tris-HCl(pH 8.0),10mM EDTA(pH 8.0)。1M Tris-HCl(pH 8.0)12.5ml,0.5M EDTA(pH 8.0)10ml,葡萄糖4.730g,加ddH2O至500ml。在10 lbf/in2高压灭菌15min ,贮存于4℃。
2. 溶液Ⅱ:0.2N NaOH,1% SDS。2N NaOH 1ml,10%SDS 1ml,加ddH2O至10ml。使用前临时配置。
3. 溶液Ⅲ:醋酸钾(KAc)缓冲液,pH 4.8。5M KAc 300ml,冰醋酸 57.5ml,加ddH2O至500ml。4℃保存备用。
4. TE:10mM Tris-HCl(pH 8.0),1mM EDTA(pH 8.0)。1M Tris-HCl(pH 8.0)1ml,0.5M EDTA(pH 8.0)0.2ml,加ddH2O至100ml。15 lbf/in2高压湿热灭菌20min,4℃保存备用。
5.苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)
6.乙醇(无水乙醇、70%乙醇)
7. 5×TBE:Tris 碱54g,硼酸27.5g,EDTA-Na2?2H2O 4.65g,加ddH2O 至1000ml。15 lbf/in2高压湿热灭菌20min,4℃保存备用。
8.溴化乙锭(EB):10mg/ml
9.RNase A(RNA酶A):不含DNA酶(DNase-free) RNase A的10mg/ml,TE配制,沸水加热15min,分装后贮存于-20℃。
10. 6×loading buffer(上样缓冲液):0.25%溴酚蓝,0.25%二甲苯青FF,40%(W/V)蔗糖水溶液。
11. 1% 琼脂糖凝胶:称取1g琼脂糖于三角烧瓶中,加100ml 0.5×TBE,微波炉加热至完全溶化,冷却至60℃左右,加EB母液(10mg/ml)至终浓度0.5μg/ml(注意:EB为强诱变剂,操作时带手套),轻轻摇匀。缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中,勿使有气泡,静置冷却30min以上,轻轻拔出梳子,放入电泳槽中(电泳缓冲液0.5×TBE),即可上样。 


三、操作步骤 


1. 挑取LB固体培养基上生长的单菌落,接种于2.0ml LB(含相应抗生素)液体培养基中,37℃、250g振荡培养过夜(约12-14hr)。
2.取1.5ml培养物入微量离心管中,室温离心8000g×1min,弃上清,将离心管倒置,使液体尽可能流尽。
3.将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ中,剧烈振荡,使菌体分散混匀。
4.加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ,颠倒数次混匀(不要剧烈振荡),并将离心管放置于冰上2-3min,使细胞膜裂解(溶液Ⅱ为裂解液,故离心管中菌液逐渐变清)。
5.加入150μl预冷的溶液Ⅲ,将管温和颠倒数次混匀,见白色絮状沉淀,可在冰上放置3-5min。溶液Ⅲ为中和溶液,此时质粒DNA复性,染色体和蛋白质不可逆变性,形成不可溶复合物,同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀。
6.加入450μl的苯酚/氯仿/异戊醇,振荡混匀,4℃离心12000g × 10min。
7.小心移出上清于一新微量离心管中,加入2.5倍体积预冷的无水乙醇,混匀,室温放置2-5min,4℃离心12000g×15min。
8.1ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀1-2次,4℃离心8000g×7min,弃上清,将沉淀在室温下晾干。
9.沉淀溶于20μl TE(含RNase A 20μg/ml),37℃水浴30min以降解RNA分子,-20℃保存备用。


四、质粒DNA的电泳检测


观察琼脂凝胶中DNA的最简单方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色。该物质含有一个可以嵌入DNA的堆积碱基之间的一个平面基团,这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近,导致染料与DNA结合并呈现荧光,其荧光产率比游离染料溶液有所增加。DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料,而被结合的染料本身则在302nm和366nm有光吸收。这两种情况下,被吸收的能量可在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来。因此,当凝胶中含有游离溴化乙锭时即可以检测到少量的DNA。


取制备的质粒DNA 1-2μl,加适当loading buffer混匀上样,采用 1-5V/cm的电压,使DNA分子从负极向正极移动至合适位置,取出凝胶置紫外灯下检测,摄片。


五、注意事项 


本裂解法小量制备质粒 DNA重复性好,一般无麻烦。若所提取质粒 DNA不能被限制性内切酶切割,可通过酚/氯仿再次抽提,以清除杂质来解决问题。


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