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真核细胞DNA的制备与定量

一、实验原理


制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤,通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素,以保证DNA的完整性,为后续的实验打下基础。一般真核细胞基因组DNA有107-9bp,可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取,常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞,随后用酚抽提而实现的。这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析,还可用于PCR的模板、文库构建等实验。


根据材料来源不同,采取不同的材料处理方法,而后的DNA提取方法大体类似,但都应考虑以下两个原则:

(1)防止和抑制DNase对DNA的降解;(2)尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。


二、试剂准备


1.TE: 10mM Tris-HCl (pH 7.8); 1mM EDTA (pH 8.0)。
2.TBS: 25mM Tris-HCl (pH 7.4); 200mM NaCl; 5mM KCl。
3.裂解缓冲液:250mM SDS; 使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。
4.20% SDS
5.2mg/ml蛋白酶K
6.Tris饱和酚(pH 8.0)、酚/氯仿(酚∶氯仿=1∶1)、氯仿
7.无水乙醇、75%乙醇


三、操作步骤


(一)材料处理
1.新鲜或冰冻组织处理:
⑴ 取组织块0.3-0.5cm3, 剪碎,加TE 0.5ml,转移到匀浆器中匀浆。
⑵ 将匀浆液转移到1.5ml离心管中。
⑶ 加20% SDS 25 ml,蛋白酶K (2mg/ml) 25 ml,混匀。
⑷ 60°C水浴1-3hr。
2.培养细胞处理:
⑴ 将培养细胞悬浮后,用TBS洗涤一次。
⑵ 离心4000g×5min,去除上清液。
⑶ 加10倍体积的裂解缓冲液。
⑷ 50-55°C水浴1-2hr。
(二)DNA提取
1. 加等体积饱和酚至上述样品处理液中,温和、充分混匀3min。
2. 离心5000g×10min,取上层水相到另一1.5ml离心管中。
3. 加等体积饱和酚,混匀,离心5000g×10min,取上层水相到另一管中。
4. 加等体积酚/氯仿,轻轻混匀,离心5000g×10min,取上层水相到另一管中。如水相仍不澄清,可重复此步骤数次。
5. 加等体积氯仿,轻轻混匀,离心5000g×10min,取上层水相到另一管中。
6. 加1/10体积的3M醋酸钠(pH 5.2)和2.5倍体积的无水乙醇,轻轻倒置混匀。
7. 待絮状物出现后,离心5000g×5min,弃上清液。
8. 沉淀用75%乙醇洗涤,离心5000g×3min ,弃上清液。
9. 室温下挥发乙醇,待沉淀将近透明后加50-100ml TE溶解过夜。
(三)DNA定量和电泳检测
1.DNA定量:
DNA在260nm处有最大的吸收峰,蛋白质在280nm处有最大的吸收峰,盐和小分子则集中在230nm处。因此,可以用260nm波长进行分光测定DNA浓度,OD值为1相当于大约50μg/ml双链DNA。如用1cm光径,用 H2O稀释DNA样品n倍并以H2O为空白对照,根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度:DNA(mg/ml)=50×OD260读数×稀释倍数/1000。
DNA纯品的OD260/OD280为1.8,故根据OD260/OD280的值可以估计DNA的纯度。若比值较高说明含有RNA,比值较低说明有残余蛋白质存在。OD230/OD260的比值应在0.4-0.5之间,若比值较高说明有残余的盐存在。
2.电泳检测:
取1μg基因组DNA用行0.8%琼脂糖凝胶上电泳,检测DNA的完整性,或多个样品的浓度是否相同。电泳结束后在点样孔附近应有单一的高分子量条带。


四、注意事项


1. 所有用品均需要高温高压,以灭活残余的DNA酶。
2. 所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制。
3. 用大口滴管或吸头操作,以尽量减少打断DNA的可能性。
4. 用上述方法提取的DNA纯度可以满足一般实验(如Southern 杂交、PCR等)目的。如要求更高,可参考有关资料进行DNA纯化。


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