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Nature:RNA甲基化是RNA结构“开关”

2月26日出版的Nature,报道了芝加哥大学关于m6A修饰通过改变RNA结构来影响RNA-蛋白互作过程的最新研究成果。


在RNA分子腺嘌呤第6位氮原子上的甲基化修饰(N6-methyladenosine,m6A)是高等生物RNA上含量最为丰富的一种修饰形式。这种修饰会参与到很多转录后调控过程中,与多种生理功能有关,是一类极为重要的表观修饰。


本项研究中,研究者首先在一个与肺癌转移相关的lncRNA——MALAT1的茎环结构上发现了一个m6A修饰位点——2577-A/m6A,该位点修饰状态会改变数种核酸酶对MALAT1的消化能力。RNA pull down确认,2577-m6A位点会增强一种名叫HNRNPC的蛋白在多聚尿嘧啶结构处的结合能力,该蛋白会通过结合新生mRNA多聚尿嘧啶区域影响其靶点的稳定性、剪切、运输及翻译过程。研究者将这个修饰位点称为m6A开关(m6A-switch)。


此后,研究者选择HEK293T细胞,通过两个实验在全转录组范围内验证m6A开关是否在其他转录本中广泛存在。第一个实验为CLIP+二维薄层色谱(CLIP-2dTLC),该实验将CLIP与TLC实验相结合,发现在HNRNPC结合的RNA区域附近,m6A/A比例明显更高,且这些区域对m6A抗体亲和性也更强。接下来再通过PAR-CLIP+meRIP-Seq,在全转录组范围确定HNRNPC结合区域附近m6A具体位置。HNRNPC PAR-CLIP-meRIP-Seq分析表明,m6A主要集中于GRACH motif(RRACH的一个子集),HNRNPC的多聚尿嘧啶结合域和GRACH域分布在50nt范围内,且m6A主要分布于内含子中,这也与之前发现的HNRNPC主要结合于初级新生转录本的现象一致。


为了了解m6A缺陷对RNA-HNRNPC互作的影响,研究者又使用敲除了甲基转移酶METTL3和METTL14的细胞进行PAR-CLIP实验,结果表明RNA-HNRNPC互作被明显减弱。若将细胞内METTL3、METTL14和HNRNPC同时敲除,有接近1000个包含m6A开关的转录本出现变化,GO分析表明这些转录本所对应的基因与细胞增殖等生物过程有关。除了转录水平上的变化,当METTL3、METTL4和HNRNPC同时被沉默时,包含m6A开关的转录本的剪切形式也出现变化,HNRNPC/METTL3共沉默会造成258个外显子水平变化,HNRNPC/METTL14共沉默则会造成245个外显子水平变化,且这些外显子主要集中于m6A开关附近,也表明m6A最容易影响邻近外显子剪切形式。


实验结果说明,转录后的m6A修饰可以通过调控RNA-HNRNPC互作来影响编码以及非编码RNA的结构,从而进一步影响核内基因转录及成熟过程,这可能是由于m6A在影响HNRNPC与RNA结合能力的同时,还会进一步招募其他的辅助因子,例如YTH结构域蛋白等,这些因子也都会对直接识别m6A并影响RNA结构。


本项研究表明m6A通过控制RNA-蛋白互作来影响mRNA和lncRNA的转录后调控,并进一步影响一些重要的生物学过程,对于RNA表观修饰研究具有重要意义。


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